中-兽医科学2021，51 (04):475-482
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2021-01-25 D O I:10.16656/j.issn. 1673-4696.2021.0065 中图分类号：S852.695.5 文献标志码：A文章编号：1673-4696(2021)04-0475-08基因V H型新城疫病毒融合前构象F蛋白的表达及 结构分析
陈林娜，孙军峰，李乐，师乾凯，邸涛，刘添仪，赵冉，张春玮，
韩宗玺，刘胜旺*
(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)
摘要：目前，新城疫病毒（N D V)融合蛋白（F)的融合前构象是未知的，为获得具有融合前构象的N D V F 蛋白，本研究对基因VH型N D V C K/C H/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化，将其克隆至真核表达栽体中构建获得了重组质粒p C A G-optiF。通过SWISS-M O D E L网站对蛋白结构进行 预测，结果显示，质粒p C A G-optiF编码的蛋白能够形成与人呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象相似的结 构。将质粒p C A G-optiF转染至鸡源细胞L M H中，通过间接免疫荧光试验证实构建的蛋白在鸡源细胞中成 功表达。将质粒p C A G-optiF转染悬浮培养的Expi293F细胞，表达并纯化获得重组蛋
白roptiF。SDS-PAGE 电泳结果显示获得了与预期大小相符的蛋白。Western-blotting结果显示，表达的roptiF蛋白能够与N D V C K/C H/LHLJ/1/06株的抗血清反应。进一步通过负染电子显微镜观察roptiF蛋白结构，结果显示，roptiF 蛋白具有典型的F蛋白融合前构象的结构特征。本研究成功获得了具有融合前构象的基因W型N D V F蛋 白，并且该蛋白能够与抗N D V的血清反应，本研究结果为研制新型N D V疫苗奠定了基础。
关键词：新城疫病毒；基因W型；F蛋白；融合前构象
Expression and structural analysis of F protein of genotype V H Newcastle disease virus with pre-fusion conformation CHEN Lin-na，SUN Jun-feng，LI Le，SHI Qian-kai，DI Tao,LIU Tian-yi，ZHAO Ran,ZHANG Chun-wei，
HAN Zong-xi,LIU Sheng-wang*
(State Key Laboratory o f V e terinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute , Chinese Academy o f A gricultural
Sciences .Harbin 160069.China)
Abstract：At present,the pre-fusion conformation of the Newcastle disease virus (NDV) fusion(F) pro
tein is still unknown. In this study,in order to obtain the NDV F protein with pre-fusion conforma tion,the sequence which encoded the extracellular region of F protein of genotypeVD NDV CK/CH/LHLJ/1/ 06 strain was modified and optimized,and subsequently cloned it into the eukaryotic expression vector to construct the recombinant plasmid pCAG-optiF. The structure of protein encoded by pCAG-optiF was predicted by SWISS-MODEL website,the result showed that the protein could form a structure which similar to the F protein of human respiratory syncytial virus with prefusion conformation. Then the plasmid pCAG-optiF was transfected into chicken origin LMH cel Is, the expression of protein in LMH cells was examined by indirect immunofluorescence assay. The plasmid pCAG-optiF was further transfected into suspension cultured Expi293F cel Is,and the recombinant protein roptiF was expressed and purified. The
收稿日期：2020-12-15；修回日期：2021-01-22
基金项目：国家自然科学基金项目（31872504)；国家重点研发计划项目（2018YFD0501302)
作者简介：陈林娜（1994-)，女，河南商丘人，硕士生，£-11^11:(；11119950116@163.(：〇111。*通讯作者：刘胜旺，研究员，博士，主 要从事动物传染病及分子病原流行病学研究，E-mail :liushengwang@caas. cn。
包装箱制作476中国兽医科学第51卷
result of polyacrylamide gel electrophoresis showed that the protein with the expected molecular weight was obtained. Western-blotting result showed that the recombinant protein roptiF could be recognized by anti-serum of NDV CK/CH/LHLJ/1/06 strain. The structure of the recombinant protein roptiF was further observed under negative staining electron microscope,and the result showed that the recombinant protein roptiF presented typical structural characteristics of the pre-fusion conformation of F protein. In summary,F protein of genotypeVD NDV with pre-fusion conformation was successfully expressed in this study,and the obtained protein could be recognized by anti-NDV serum. The results of this study provided a basis for the development of novel NDV vaccine.
Key words：NDV;genotypeVD;Fprotein;pre-fusion conformation
* Corresponding author：LIU Sheng-wang, E-mail ：liushengwang@caas. cn
新城疫（Newcastle disease,N D)是由新城疫病 毒（Newcastle disease virus ,N D V)引起的一种禽类 的急性、高度接触性的烈性传染病[H]。世界动物卫 生组织（OIE)将该病列为必须报告的动物疫病，我 国将其列为一类动物疫病，《国家中长期动物疫病 防治规划（2012_2020年）》将其列为优先防控的重 大动物疫病。基于基因组大小和融合蛋白（flision, F)基因的遗传演化分析，N D V分为class I
和class II两类。其中，class I毒株基因组长度为15 198 b p，所有的class I毒株属于1个基因型；class II毒株基 因组长度包括15 192 b p和15 186 b p两种，可进一 步分为21个基因型[5]。自1926年N D被首次报道 以来，世界范围内发生过四次N D大流行，每次大流 行都是由特定基因型的N D V毒株所引起的。我国 采取了严格的免疫策略对N D进行防控，其中应用 最广泛的疫苗株是class II中的基因II型LaSota。然 而,class II类中的基因VD型强毒株仍然能够在免疫 鸡中持续存在，并被认为是自20世纪90年代以 来造成中国和其他多个亚洲国家N D发生的主要 N D V基因型流行的基因VD型强毒株与基因I I 型疫苗株之间的遗传和抗原性差异是造成基因V I I 型N D V在免疫鸡中感染和排毒的主要原因。
N D V含有两种囊膜糖蛋白，血凝素一神经氨酸 酶(H N)蛋白和F蛋白，二者是病毒感染和致病所 必需的，并能诱导机体产生针对N D V的保护性免 疫^ H N和F蛋白均能刺激机体产生中和抗体，但F 蛋白诱导产生中和抗体和保护性免疫的能力优于 H N蛋白w。与副黏病毒科其他成员相似，N D V F蛋 白是一种丨型膜蛋白，首先合成非活性前体形式 F0,F0随后被切割为F1和F2两个亚单位并由二 硫键连接，形成亚稳定融合前构象。N D V弱毒力毒 株F蛋白在裂解位点处含有单个碱性氨基酸残基 112G R Q G R丨L117，只能被胰样蛋白酶所切割；而中 等毒力毒株和强毒力毒株在裂解位点处含有多个碱性氨基酸残基112R R Q R R I L117，能够被普遍存 在于组织细胞中的弗林样蛋白酶所切割％。病毒感 染过程中，H N蛋白与受体结合，随后H N蛋白与F 蛋白相互作用，导致F蛋白发生一系列不可逆的构
象变化，最终形成高度稳定的融合后构象，并介导 病毒囊膜与细胞融合[11]。目前N D V F蛋白融合后 构象的晶体结构已被解析，与人呼吸道合胞体病毒 (H R S V)F蛋白融合后构象的折叠方式相似。据报 道，中和抗体在H R S V感染中发挥重要的保护作用。
H R S V F蛋白融合前构象和融合后构象均含有被中 和抗体识别的表位，但H R S V自然感染产生的中和 抗体主要识别F蛋白融合前构象中的表位。并且作 为一种免疫原，H R S V融合前构象的F蛋白可以在 动物模型中诱导特异性中和抗体产生[12_13]。此外，牛呼吸道合胞体病毒（B R S V)融合后构象F蛋白免疫 犊牛后能针对B R S V提供有效的临床保护:M i。鉴于 H R S V和N D V的F蛋白融合后构象呈现相似的折 叠模式，推测N D V F蛋白融合前构象可能类似于 H R S V和BRS V F蛋白融合前构象，能够诱导机体产 生高水平中和抗体，从而有望作为N D V的新型亚 单位疫苗。有研究者利用杆状病毒系统尝试表达 N D V F蛋白，成功测定了其融合后构象的晶体结 构，但由于杆状病毒表达的蛋白糖基化修饰不完全 以及存在结构不稳定等其他因素，未成功获得具有 融合前构象的F蛋白:15]。
为获得具有稳定融合前构象的N D V F蛋白，本 研究对基因W型N D V毒株的F基因进行修饰，引人了一系列的突变位点和T4噬菌体的Fibritin三 聚体结构域使其保持融合前构象，并将密码子优化 使其符合鸡的密码子偏好性，优化后的基因克隆至 高效真核表达载体中，转染悬浮培养的真核细胞表 达获得了相应的重组蛋白，并对纯化的重组蛋白进 行鉴定和结构测定，以期为研制新型N D V疫苗提 供理论基础。
第4期陈林娜等：基因W型新城疫病毒融合前构象F蛋白的表达及结构分析477
1材料与方法
1.1主要试剂及材料
鸡肝癌细胞系L M H细胞、悬浮培养的Ex- pi293F细胞和真核表达质粒p C A G G S由中国农业 科学院哈尔滨兽医研究所禽呼吸道病创新团队保 存。ln-Fusion H D Cloning kits、D N A Marker、E.cotf D H5ct感受态细胞均购自宝生物工程（大连）有限公 司生产。收试剂盒和小提质粒试剂盒购自◦mega公司。限制性内切酶购自N E B公司。P C R高保真酶K O D-Plus-N e o购自Toyobo公司。考马斯 亮蓝染液购自北京索莱宝科技有限公司。Tur_ bofect转染试剂、ExpiFectamine29转染试剂盒、蛋 白Marker购自Thermo Scientific公司。胎牛血清、
D M
E M购自Sigma公司。
1.2序列优化与质粒构建
以基因 vn 型N D V 毒株 C K/C H/LHLJ/1/06 (GenBank登录号：K U140419)F基因编码区序列为 基础
构建质粒，参照鸡的密码子偏好性对其进行优 化，将编码第 16、24、28、71、78、146、154、162、402、480 和489位氨基酸残基的密码子突变，使其编码的氨 基酸分别发生以下突变：16V—161、24G—24S、28S-> 28L、71R—71K、78K—78R、146K—146Q、154L—1541、162N—162P、402T—402A、480K—480R、489E—489D,
表1PC R扩增引物
Table 1Primers for PCR amplification 并将编码裂解位点“R R Q K R F”的序列突变为编码 “G G Q G R F”的序列，使裂解位点不能被细胞中的弗 林样蛋白酶切割。为表达可溶性蛋白，去除掉F基 因的跨膜区（T M)和胞浆尾部序列（C T)序列，用T4 噬菌体Fibritin的异源三聚体结构域序列，弥补 缺失的T M序列使表达的蛋白形成稳定的可溶性三 聚体，并在末端添加His和Strep标签编码序列用 于蛋白的纯化。设计优化的F基因序列由北京六合 华大基因科技有限公司合成并克隆至P M D18-T载 体上。
根据真核表达载体p C A G G S的序列设计引物 p C A G G S-F和p C A G G S-R，用高保真K O D聚合酶 通过P C R扩增获得载体片段。根据设计优化的F基 因序列设计引物叩t i-F-F和opti-F-R，在引物两端 加上与B a m H I和Xho I酶切后的p C A G G S载体两 个末端同源的15 b p碱基序列，用高保真K O D聚合 酶通过P C R扩增获得优化的F基因片段，使用 In-Fusion试剂盒将P C R扩增获得的载体片段和F 基因片段连接并转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑 取单个菌落培养后提取质粒。用引物opti-F-F和o
pti-F-R对质粒P C R鉴定，用B a m H I和Xho I对 质粒酶切鉴定，P C R和酶切鉴定为阳性的质粒送测 序验证，测序正确的质粒命名为p C A G-optiF。引物 见表1，由北京六合华大基因科技有限公司合成。
引物名称Primer names序列（5’—>3’）Sequence片段长度 /bp Product length pCAGGS-F taggatccagatctgctgtgccttctagttgccag
5 790
pCAGGS-R ggtggcctcgaggaattctttgccaaaatgatgag
opti-F-F ttcctcgaggccaccatgggcagcaagcccagcac
1665
opti-F-R cagatctggatcctatcacttctcgaactgggggt
下划线字母表示与B o m H I和丨酶切后的p C A G G S载体末端同源的序列,，
Underlined letters represents the sequences homologous with terminal sequence of p C A G G S plasmid digested by BamH I and Xho I .
1.3 F基因编码蛋白结构预测
以H R S V融合前构象F蛋白的晶体结构（P D B 登录号为5E A3)作为模型，利用SW IS S-MO DE L (https :///)进行同源建模，预 测本研究设计优化的F基因序列所编码蛋白的构 象，用U C S F Chimera 1.8.1软件对预测的蛋白结构 进行分析。
1.4 F蛋白的表达、纯化及鉴定冷凝水回收装置
间接免疫荧光(IFA)检测：将鸡肝癌细胞(L M H)在12孔板细胞板中培养，待其生长至80%〜90%密度时，使用Turbofect转染试剂将质粒p C A G-optiF转染至L M H细胞中。转染48 h后，将细胞上 清弃去，用P B S清洗细胞3次，然后用4%的多聚甲 醛固定细胞，P B S清洗3次后用0.1 %的Triton X-100透膜处理15 min。P B S清洗3次后加人在鸡 中制备的基因VII型N D V C K/C H/LHLJ/1/06株的 抗血清，4 °C孵育过夜。P B S清洗3次后加人FITC 标记的抗鸡的二抗，37 °C孵育1 h。P B S清洗3次后 通过倒置荧光显微镜进行观察拍照。
使用Expi293F表达培养基，在10%C O2培养箱 中以120r/min的条件悬浮培养Expi293F细胞。待细 胞生长至 5 X106cells/mL 时，用 ExpiFectamine293 转
478中国兽医科学第51卷
染试剂盒将质粒p C A G-optiF转染至Expi293F细胞 中。转染后继续培养5d，收集细胞上清,10000X g离 心10 min去除细胞碎片，用镍柱琼脂糖树脂HisPur Ni-N T A和Strep-Tactin亲和谱法纯化上清液中 带有His-Strep标签的重组F蛋白（roptiF)。将纯化 的roptiF蛋白进行SDS-P A G E，用考马斯亮蓝染 鉴定。
进一步通过Western-blotting对纯化的roptiF 蛋白鉴定，将optiF蛋白进行SDS-P A G E后利用Bio- Rad 半干转膜仪将蛋白电转移至硝酸纤维素膜(N C)上，加人5%脱脂乳溶液，于4 °C封闭过夜。弃 去封闭液，加人适量P B S T对膜清洗，重复三次，将 N D V C K/C H/LHLJ/1/06株的抗血清用2%脱脂乳 溶液按1:100稀释，37 °C孵育l h。孵育后的膜 经P B S T洗涤3次，加人抗鸡的红外荧光二抗孵育，37°C避光孵育l h。用P B S T充分洗涤3次后，用 Odyssey红外突光扫描成像系统对膜进行扫描。
1.5电镜观察蛋白形态结构
按照文献[18]报道的方法处理纯化的重组蛋 白roptiF，以同样方法在Expi293F细胞中表达获得 的野生型N D V C K/C H/LHLJ/1/06株F蛋白作为 对照，用负染电子显微镜观察蛋白的形态结构[14]。
2结果
2.1质粒pCAG-optiF的构建及鉴定
用高保真聚合酶通过P C R扩增得到线性化的 p C A G G S载体以及优化的F基因序列片段后，将二 者连接并转化至大肠杆菌感受态细胞，挑取单个菌 落培养后提取质粒进行酶切和P C R鉴定。结果显 示，将重组质粒用S a m H I和Xho I限制性内切酶 双酶切后经核酸电泳检测，观察到大小分别为约5 775 b p的载体片段和1 680 b p的F基因片段。以重组质 粒为模板，用引物opti-F-F和opti-F-R P C R扩增，经核酸电泳检测可见一条约1 665 b p的目的条带，与预期大小相符。将鉴定正确的质粒送测序验证，测序正确的质粒命名为p C A G-optiF。
2.2 F蛋白结构的预测
将设计优化的F基因编码序列翻译为氨基酸 序列后，通过SWISS-M O D E L网站，以H R S V F蛋白 融合前构象的晶体结构（P D B登录号为5E A3)作为 模型，预测p C A G-optiF质粒所编码蛋白的构象。蛋 白结构模拟结果显示，重组质粒p C A G-optiF编码 的蛋白与H R S V F蛋白融合前构象结构相似，呈椭 圆形球状，符合F蛋白融合前构象特征（图1A)。并 且与H R S V融合前F蛋白的折叠方式类似，预测的pCAG-optiF质粒所编码蛋白的近膜端由2层p- 折叠（绿阴影标记的氨基酸）和3个c t-螺旋（黄 阴影标记的氨基酸）组成，而远膜端由7个a-螺 旋和一个发夹组成（图1B)。结构模型中显示的为 参与形成融合前蛋白构象的第94位〜第481位氨 基酸残基以及162位脯氨酸残基。
2.3 F蛋白的表达、纯化及鉴定网络收集
涡轮分子泵
为检测优化的F基因能否在鸡源细胞中成功 表达，将构建的质粒pCAG-optiF转染至鸡源细胞 L M H中，p C A G G S空载体转染L M H细胞作为阴性 对照。转染后48h固定细胞，基因VE型N D V C K/ C H/LHLJ/1/06株在鸡中制备的抗血清作为抗体，检测L M H细胞中F蛋白的表达。结果如图2所示，pCAG-optiF转染的L M H细胞中能够观察到明显 的绿荧光，而空载体p C A G G S转染的L M H细胞 中未观察到绿荧光。上述结果表明，质粒p C A G- optiF在鸡源细胞中能够表达编码的F蛋白，并且 表达的蛋白可以被N D V抗体所识别。
将质粒pCAG-optiF转染至悬浮培养的Ex- pi293F细胞中，收集上清并用HisPur N i-N T A和Strep-Tactin纯化重组蛋白，纯化获得的重组蛋白 命名为roptiF。将roptiF蛋白进行S D S-P A G E并用 考马斯亮蓝染。结果如图3A所示，在脱后的蛋 白胶上观察到一条分子质量约为70 k u的蛋白条 带。本研究设计构建的F基因所表达的重组蛋白裂 解位点处的氨基酸残基不含有多个碱性氨基酸，不 能被细胞中的弗林样蛋白酶切割成F1和F2两个亚 单位，因此只观察到单一的蛋白条带。另外，本研究 构建的F基因所表达的蛋白分子质量理论上为58 ku，而F蛋白中存在4个糖基化修饰位点，每个位点 发生糖基化修饰会导致分子质量增加2〜3 ku
因此，本研究表达获得的蛋白应该发生了糖基化修 饰，这对于维持F蛋白的结构和功能至关重要。进 一步通过Western-blotting方法对roptiF蛋白鉴 定，使用N D V C K/C H/LHLJ/1/06株的抗血清作为 一抗，结果显示roptiF蛋白能够被其识别，表明表 达获得的重组蛋白roptiF含有能够被N D V抗体所 识别
的抗原表位（图3B)。
2.4 F蛋白的形态结构观察
为进一步确认本研究构建获得的重组roptiF 蛋白能够形成融合前构象，将roptiF蛋白按文献报 道的方法处理后用电子显微镜观察，以能够形成融 合后构象的野生型N D V C K/C H/LHLJ/1/06株F 蛋白作为对照。结果如图4A所示，重组蛋白roptiF 在电镜下呈现与H R S V F 蛋白融合前构象相似的椭
第4期陈林娜等：基因vn型新城疫病毒融合前构象f蛋白的表达及结构分析479
A
B93 T P L G D S I R K I Q G S V S T S G G G G Q G R F I G A V I G S V A L G V A T A A Q I T A A A A L I 143fQANQ|NAA|N I l R l KESII AATP——TDG—AVGKMQQF VNDQF N N
193 TARE LDC I K I TQQVGVEL N L Y L T E L T T VFGPQ I TSPA L TQ L T I QAL Y N L A
243^GGNMDYLLTKlLG IGlNNQLSSlL I G S G L i H P I L YD SQTQ L L G l M|L PSV
293 G N L N N M H H Y L E T L S V S T T K G f lllA L V P i B B S V D C m Y H t)
343 I Y S C L S G N T S A C M Y f l||E G A L T M IB A L K f lH|H
393|C K I T T_|||P P G H||H Y G E H|M R H S C N m D G f l H|B L S G E F D A
443 TYQKN I S I LDSQV I VTGNLD I STELGNVNNS I SNALDRL
图1F蛋白结构建模
Figure 1Structural model of NDV F protein
A：预测的F蛋白融合前构象；B：参与形成a-螺旋和p-折叠的氨基酸。
A：Predicted pre-fusion conformation of F protein ；B ：The amino acids involved i n the formation of a-helix and (3-sheet.
pCAG-optiF p C A G G S
图2间接免疫荧光鉴定L M H细胞中F蛋白的表达
Figure 2 Identification of F protein expressed in LMH cells by indirect immunofluorescence
球状三聚体形态。而野生型F蛋白是融合后构象呈 拉长的三角形结构（图4B)，表明重组蛋白roptiF能 够形成典型的融合前构象形态。
条纹码
3讨论卵黄磷蛋白
作为副黏病毒家族中的一种I型膜蛋白，N D V F蛋白最初以一种亚稳定的融合前构象形态存在，并在病毒入侵过程中重新折叠形成稳定的融合后 构象，从而启动病毒囊膜与宿主细胞膜的融合。目前，仅F蛋白融合后构象的晶体结构被成功测定，并且其折叠模式与H R S V F蛋白融合后构象相似。之前有研究尝试得到融合前构象N D V F蛋白，该研 究将F基因中编码T M和C T的区域替换为GCN t 三聚体结构域的编码序列，
并利用杆状病毒表达系
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议