2021 年 1 月 Vol. 39 No.1
January 2021
Chinese Journal of Chromatography
15-25
青年编委专辑（上）•专论与综述
DOI ： 10.3724/SP.J. 1123.2020.05036
郑鑫彤2，王 雪2，张福生2，张旭阳2，赵艳艳1，卿光焱2*
（1.大连医科大学药学院，辽宁大连116044 ； 2.中国科学院分离分析化学重点实验室，
中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连116023）
收稿日期：2020-06-05
* 通讯联系人.Tel ：(0411) 84379050,E-mail :qinggy@ dicp.ac .
基金项目：国家自然科学基金(21775116,21922411 )；大连化学物理研究所创新基金(DICP-RC201801 )；兴辽英才项目
(XLYC 1802109).
Foundation item ： National Natural Science Foundation of China ( Nos. 21775116, 21922411) ； Dalian Institute of Chemical
Physics Innovation Funding ( No. DICP-RC201801 ) ； Liaoning Revitalization Talents Program ( No. XLYC 1802109).
摘要：翻译后修饰是蛋白质组学研究的前沿和重点，它不仅调节着蛋白质的折叠、状态、活性、定位以及蛋白质间的 相互作用，也能帮助科学家更全面地了解生物体的生命过程，为疾病的预测、诊断和提供更加强大的支撑和依
据。翻译后修饰产物（例如磷酸化肽和糖肽）丰度很低，且存在着强烈的背景干扰，很难直接用质谱进行分析，因此
迫切需要开发高效的富集材料和技术来选择性富集翻译后修饰产物。近年来，智能聚合物基材料通过外部物理、
化学或生物刺激可逆地改变其结构和功能，实现对磷酸化肽和糖肽高度可控的吸附和脱附，进而衍生开发出一系 列新颖的富集方法，极大地吸引研究者们的兴趣。一方面，智能聚合物基材料的响应变化包括材料疏水性的增加 或减少、形状和形貌的改变、表面电荷的重新分布以及亲和配体的暴露或隐藏等特性。这些特性使得目标物和智 能聚合物基材料之间的亲和力可以通过简单改变外部条件（如温度、pH 值、溶剂极性和生物分子等）实现更可控和 更智能的精细调节。另一方面，智能聚合物基材料为集成功能模块提供了便捷的可扩展平台，例如特定的识别组 件，显著提高了目标物质的分离选择性。智能聚合物基材料在分离方面展现出巨大的潜力，这为蛋白质翻译后修 饰产物的分析和研究带来了希望。围绕上述主题，该文依据Web of Science 近20年来近50篇代表性文献，概述 了智能聚合物基材料在磷酸化肽和糖肽分离及富集中的发展方向。
关键词：蛋白质组学；富集；翻译后修饰；智能聚合物；磷酸化肽；糖肽；综述
中图分类号：O658
文献标识码:A 文章编号：1000-8713（2021）01-0015-11
Advances in enrichment of phosphorylated peptides and
glycopeptides by smart polymer-based materials
ZHENG Xintong 1，2, WANG Xue 2, ZHANG Fusheng 2, ZHANG Xuyang 2,
ZHAO Yanyan 1 , QING Guangyan 2 *
（1. Pharmacy College , Dalian Medical University , Dalian 116044, China ；2. Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry , Dalian Institute of Chemical Physics , Chinese Academy of Sciences , Dalian 116023, China ）
Abstract : Protein post-translational modification （PTM ） is at the forefront of focus of pro
teomics research. It not only regulates protein folding , state , activity , localization , and protein interactions , but also helps scientists understand the biological processes of organisms more comprehensively , providing stronger support and basis for the prediction , diagnosis , and treat ment of diseases. In living organisms , there are more than 300 types of PTMs of proteins and their modification processes are dynamic. At the same time , protein modifications do not exist in isolation. The occurrence of the same physiological or pathological process requires the joint action of various modified proteins , which affect and coordinate with each other. Owing to the
・16・谱第39卷
卿光焱：主要从事智能生物分离材料方面的研究工作，开发了一系列生物分子响
应性聚合物材料、手性功能表面和面向翻译后修饰蛋白质组学的聚合物基富集材
料。以第一或通讯作者在Nat Comm（1篇），Adv Mater（3篇），J Am Chem Soc
（5篇），Angew Chem Int Ed（2篇），Chem Sci（2篇），NPG Asia Materials（3
篇），TrAC-Trends Anal Chem（2篇）等国际知名权威期刊上发表SCI论文60
篇，其中影响因子10以上的论文13篇，参与发表论文37篇，他引1300余次；申报
国家发明专利10项，授权15项。主持国家自然科学基金面上项目3项、青年科学
基金项目1项、科技部973重大研究计划三级子课题1项，作为骨干成员参与3项
国家自然科学基金面上项目、德国Sofja Kovalevskaja Award、基金委创新团队、长
江学者创新团队项目的研究工作，并以第二完成人获得了2011年湖北省自然科学
一等奖。2012年12月被评选为湖北省楚天学者特聘教授，2014年7月获得湖北
省杰出青年基金资助。2017年4月入选武汉理工大学青年拔尖人才支持项目。
2018年1月在中科院大连化物所生物技术部成立生物分离与界面分子机制创新特区组，担任研究组组长、特聘研究员、博士生导师。2018年12月入选辽宁省“兴辽英才计划”海内外高层次人才引进集聚计划创新领军人才。
2019年8月获得国家基金委优秀青年基金资助，入选大连化物所张大煜青年学者，2019年11月入选辽宁省百千万人才工程“千”层次。
low abundance of PTM ,phosphorylated peptides or glycopeptides)and the presence of strong background interference,it is difficult to analyze them directly through mass spectrometry.Therefore,the development efficient materials and techniques for the selective enrichment of PTM peptides is urgently needed.Conventional separation methods have partially solved the challenges involved in the enrichment of glycopeptides and phosphorylated peptides；however,there are some inevitable issues,such as the excessive binding force of metal ions
(e.g.,Fe3+and Ti4+)toward multiple phosphorylated peptides,resulting in difficulty in elution and identification through mass spectrometry.In addition,owing to the insufficient binding affinity of materials toward glycopeptides,most glycopeptides that have been identified at present are of the sia
lic acid type,and a large number of neutral glycans,for instance,O-link glycopeptides and high mannose-type glycans are difficult to enrich and identify.
The emergence of smart polymers provides a new avenue for the development of PTM-enriched materials.Several studies have reported that smart polymers can reversibly change their structure and function through external physical,chemical,or biological stimulation,to achieve highly controllable adsorption and desorption of phosphorylated peptides and glycopeptides.Based on this strategy,a series of novel enrichment materials and methods have been developed,which have greatly attracted the interest of researchers.On the one hand,the response changes of smart polymers include the increase or decrease of hydrophobicity,the change of shape and morphology,the redistribution of surface charge,the exposure or hiding of affinity ligands,etc.Changes in these properties can be achieved by simply changing external conditions such as temperature,pH,solvent polarity,and biomolecules.These properties,in turn,enable the fine-tuning of the affinity between the target and the smart polymers.Furthermore,the affinity can provide an additional driving force,which can significantly improve biological separation.
On the other hand,smart polymers provide a series of convenient and expandable platforms for integrating various functional modules,such as specific recognition components,which will facilitate t
he development of novel enrichment materials for protein methylation,acetylation, and ubiquitination.Smart polymer materials show great potential in the field of separation,
第1期郑鑫彤，等：智能聚合物基材料富集磷酸化肽和糖肽的研究进展・17・
which is promising for the analysis and research of protein PTMs.This review summarizes the research progress of smart polymer materials for the separation and enrichment of phosphorylated peptides and glycopeptides according to nearly50representative articles from the Web of Science in the past two decades.
Key words:proteomics；enrichment；post-translational modification(PTM)；smart polymer；phosphorylated peptides；glycopeptides；review
自从人类基因组计划完成后，基因组学、蛋白质组学、糖组学、酶组学、代谢组学等［1-4］各种形式的“组学”研究逐渐蓬勃发展起来。蛋白质组学从整体的角度分析生物体细胞内动态的蛋白质组成，以及表达水平与翻译后修饰状态，进而了解蛋白质功能与生命体活动之间的规律；其中翻译后修饰使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。蛋白质翻译后修饰是一个非常复杂的过程，目前在真核生物中有多达300多种的修饰种类［5］，蛋白质的磷酸化和糖基化是最基础、最普遍，也是最重要的翻译后修饰方式，在信号转导、免疫应答和细胞分化等方面起着关键的调
控作用⑷。同时肿瘤的发生、发展和转移与异常的蛋白糖基化和磷酸化关系密切［7,8］，其具有十分重要的生物学意义和临床应用价值。
然而，在复杂的生物样品体系中，磷酸化蛋白和糖蛋白的含量极其微量，并且翻译后修饰动态可变性大；此外，糖肽、磷酸化肽在质谱中离子化效率低，存在强烈的背景干扰等问题，因而很难用质谱对其进行直接分析，因此迫切需要对样品进行高效的分离和富集，才能获得较高选择性和较广类型覆盖范围的磷酸化肽和糖肽。糖肽的富集方法主要包括凝集素亲和谱法⑼、肼化学法［10］、苯硼酸亲和谱法［11］、亲水谱法［12］等。磷酸化肽的富集方法主要有固定金属离子亲和谱法［13］和金属氧化物亲和谱法［14］等，而这些传统的分离方法部分解决了糖肽和磷酸化肽富集的难题，但是也有一些不可避免的问题，例如基于金属离子对多磷酸化肽的结合力过大，导致其难以洗脱和被质谱鉴定。此外，材料对糖肽的捕获效率不足，目前被鉴定出的糖肽大多为唾液酸型，大量的中性糖、O-糖肽难以被富集和鉴定。
智能聚合物基材料是一类新涌现的材料，基于自身的智能属性，即其物理和化学性质（例如高分子构象、表面形貌、浸润性、黏弹性、吸附性能等）对温度、pH值、溶剂、光、电场或生物分子等外界刺激，具有灵敏、快速、显著和可逆的响应性，已被广泛应用于纳米材料、生物、医学等多个领域［15-17］。借助
聚合物链可控的构象转变及由此产生的开-关效应，智能聚合物基材料在可控药物递送和释放、组织工
桶盖
程等方面展现出很好的应用前景，但其在分离分析领域的潜力还未引起人们足够的关注。新型材料设计理念的引入，有可能开发出对生物、医药和环境中特殊生物分子灵敏和高效的分离技术与检测方法。对于翻译后修饰蛋白质组学而言，更需要融入先进的方法和技术，以显著提升富集的效率和对修饰肽链的覆盖率，从而弥补现有富集材料在富集效率和覆盖率方面的不足。近年来，智能聚合物基材料在磷酸化肽和糖肽分离及富集领域取得了一些进展（见表1），为此我们撰写本篇综述，总结智能材料在该领域中的应用现状，分析其优势、问题，以迎接未来的挑战。
1智能聚合物基磷酸化肽富集材料
蛋白质磷酸化是指蛋白质分子中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基在蛋白激酶的作用下，从三磷酸腺苷（ATP）分子上获取磷酸基团而发生磷酸化的过程。磷酸化是大自然中最广泛的翻译后修饰形式，据统计，在哺乳动物细胞中，30%以上的蛋白质会发生不同程度的磷酸化。同时，蛋白质磷酸化又是一个可逆过程，在磷酸酯酶的作用下，磷酸化的氨基酸残基又可以发生去磷酸化过程。蛋白质磷酸化尽管修饰形式和基团较为简单，但是却在生命活动中扮演着极为重要的角，例如调节大量细胞活动如信号转导、细胞分裂、分化和代谢等［29-32］。此外，在病理意义上，异常磷酸化更是与许多人类疾病密切相关，如阿尔茨海默病（AD）［33］和癌症。阿尔茨海默病的病理特征之一就是因微管结合蛋白Tau 的异常蛋白质磷酸化所产生的神经原纤维缠结，尤其在多点磷酸化微管蛋白结合区域，可以累积成不溶性配对螺旋细丝，产生许多神经原纤维缠结。然而，值得注意的是磷酸化肽的天然丰度很
低，离子化
-18 -谱第 39 卷
PNIPAM : poly(N-isopropyl-acrylamide) ； ATBA ： 4-(3-acryloyl-thioureido)-benzoic acid ； PDA ： polydopamine ； PAMA ： poly(2-ami- noethyl methacrylate hydrochloride ) ； PGMA ： poly( glycidyl methacrylate ) ； TMIPs : thermosensitive molecularly imprinted polymers ； AA ： acrylic acid ； TP ： triarylphosphine ； b : boronic acid group-bearing ； PMMA ： polymethyl methacrylate ； Pro-Glu ： proline-glutamic ； PMAH ： poly( methacrylic hydrazide ) ； -: no data.
表1用于富集翻译后修饰产物的代表性智能聚合物基材料
Table 1 Representative smart polymer-based materials used for post-translational modification (PTM ) enrichment
Material type Target
Real biological sample Stimulus Binding mode Ref.PNIPAM-co-ATBA ().2@ SiO 2
phosphorylated peptides HeLa S3 cell lysate
pH/t emperature/ solvent polarity hydrogen bonds
[18]
PNIPAM-co-ATBA ().
超市手推车广告2@ SiO 2
phosphorylated peptides and sialylated glycopeptides HeLa cell lysate
pH
hydrogen bonds [19]Fe 3 O 4/PDA/PAMA-Arg
phosphorylated peptides
rat brain lysate solvent polarity hydrogen bonds
[20]Fe 3
。
4
@ PGMA-guanidyl phosphorylated peptides tryptic digest of nonfat milk
solvent polarity
-[21]TMIPs
phosphorylated peptides
-temperature size of the imprinting cavities
[22]Poly- ( AA-co-hydrazide)glycopeptides mouse brain lysate pH
covalent bonds [23]PNIPAM-TP polymer glycoprotein HeLa cell lysate temperature covalent bonds [24]b-PMMA spheres
glycoprotein egg white
pH/t emperature covalent bonds [25]
Poly( Pro-Glu )@ SiO 2glycopeptides HeLa cell lysate pH
hydrogen bonds [26,27]Fe 3。
4@ PMAH
glycopeptides
colorectal cancer patient serum
-
covalent bonds
bbi-142[28]
效率也较低，同时样品中还存在着大量具有强烈背 景干扰的高丰度非修饰肽段［34,35］。因此，在进行质 谱分析前，首要任务是从复杂的生物样品中高效专
一地选择性富集目标分析物，提高质谱分析样品中 磷酸化肽的浓度，并消除样品基质中非修饰肽、盐等
各类干扰成分。
可控硅散热器
多位点磷酸化是细胞中最重要且常见的修饰方 式。然而由于富集材料的限制，从复杂的生物样品
中捕获低丰度多磷酸化肽的难度很大，因此对于多 磷酸化肽的研究远远落后于单磷酸化肽。这主要是
因为基于多重金属螯合的主流方法成倍地增加了基
质金属与多磷酸化肽的亲和力，然而这种螯合作用
过于强烈，不易调控，使得结合的多磷酸化肽难以从
材料表面解离下来。除了洗脱难题，大多数富集材
料对酸性干扰肽也存在严重的非特异性吸附，大大
降低了材料的富集选择性。Qing 等［18］针对上述多 磷酸化肽的选择性富集难题设计了一种基于氢键的 智能共聚物。该共聚物包含一个高效的磷酸识别单
体-对羧基苯基硫脲(ATBA )，以及一个柔性聚N -异 丙基丙烯酰胺(PNIPAM )网络，他们将该聚合物与 多孔硅胶基质进行复合，制备了一种新型的多磷酸
化肽富集材料。该材料的特点包括材料与磷酸化肽 通过动态可逆的多重氢键进行结合；对多磷酸化肽
高度可控的吸附行为可以通过溶剂极性、pH 和温度 等环境参数进行动态调控；对磷酸化肽具有超高的
吸附容量和富集回收率；对稀有的酪氨酸磷酸化肽
展现出独特的亲和力。正是基于上述特点，该材料
成功地从人宫颈癌细胞裂解液中富集得到了 1257 条磷酸化肽(其中71%为多磷酸化肽)，并且通过质 谱鉴定发现了大量之前从未被报道的磷酸化新位
点。在这些新位点中，稀有的苏氨酸和酪氨酸磷酸
化位点的比例明显提高。智能聚合物基材料这一优
异的富集效果，揭示了其在多磷酸化肽富集中的独
特优势，为丰富和推进磷酸化蛋白组学研究提供了 一种新型、强有力的富集工具。
基于相似的策略,Lu 等［19］进一步开发了对磷 酸化肽和唾液酸糖肽具有同步富集能力的智能聚合
物基材料。他们发现对羧基苯基硫脲功能单体既可
以通过氢键作用实现对磷酸化位点的精确识别，也 可以选择性地结合唾液酸。聚合物链初始时处于紧
缩的状态，在结合多磷酸化肽或唾液酸糖肽之后发 生了从紧缩向完全舒张的转变，显著提升了对磷酸
化肽和唾液酸糖肽这些肽链的吸附(见图1)。进一
巴氏杀菌锅
步提高溶液的酸性后，强质子的环境破坏了硫脲单
元与磷酸化位点或唾液酸化位点之间的氢键作用, 使得捕获的多磷酸化肽、唾液酸糖肽又从材料表面
解离下来。 该智能共聚物具有很高的唾液酸糖肽吸 附容量(370 mg/g )和高回收率，以及高的富集选择
性，可以从50 R g 人宫颈癌细胞HeLa 细胞裂解液 中富集得到糖肽和磷酸化肽的占比为79%，从631
个磷酸化肽中产生721个独特的磷酸化位点，从
120个糖肽中产生125个独特的糖基化位点，这将
第1期
郑鑫彤，等：智能聚合物基材料富集磷酸化肽和糖肽的研究进展
-19 -
图1智能聚合物基材料对多磷酸化肽和唾液酸型糖肽的可控吸附和脱附行为⑴］
Fig. 1 Controllable adsorption and desorption behaviors of smart polymer-based materials
toward both multiple phosphorylated peptides and sialylated glycopeptides 少】
Man : mannose ； GlcNAc : N-acetyl-glucosamine ； Gal : galactose ； Neu5Ac : N-acetylneuraminic acid.
O Man ■ GIcNAc O Gal
0 Neu5Ac
为翻译后修饰富集材料的开发开辟出一条新途径。
表面引发原子转移自由基聚合技术由于接枝密
度高、聚合物链长度可控等优势，被广泛用于在不同
的基底接枝不同的聚合物。Qin 等［36］利用这种技
术开发了一种新型的毛细管柱，并成功地将其与 LC-MS 系统联合，应用于自动在线磷酸化肽的富集
和鉴定。这种聚合技术开发的新型毛细管柱从
HepG 2细胞裂解液中鉴定出475条磷酸化肽以及 662个磷酸化位点，远高于利用TiO 2在线富集的39
条磷酸化肽。更重要的是，这种聚合技术可以与各
种功能化单体有效兼容，并且不需要严苛的实验条 件，这为富集材料的开发提供了一种新思路。
2018年,Luo 等［20］通过原子转移自由基聚合技
术合成Fe 3O 4/聚多巴胺/聚(2-氨基乙基甲基丙烯
酸酯盐酸盐)-精氨酸(Fe 3 O/PDA/PAMA-Arg )纳
米复合微球。核心的PAMA-Arg 聚合物刷代替了
传统的金属离子螯合体系，有效避免了材料在上样 和洗脱过程中金属离子的流失。同时聚合物刷舒展
的三维空间结构，显著促进了精氨酸胍基与磷酸化 肽间的相互作用，实现了对磷酸化肽的高效富集。 此外,Fe s O 。良好的磁性能简化了分离过程，避免了 烦琐的离心操作，有助于磷酸化肽活性的保持。通
过简单的缓冲梯度调节，纳米微球可以实现对单、多
磷酸化肽的选择性富集。此材料不仅可以从标准蛋
白质混合物、脱脂牛奶和大鼠脑脊液中选择性富集 磷酸化肽，还可以从模型蛋白质混合物、脱脂牛奶和
蛋清中特异性捕获磷酸化蛋白质。该研究工作进一 步表明，借助多重氢键相互作用，结合聚合物链上丰
富的结合位点，可以实现对磷酸化肽的选择性富集。
由于该Fe 3O 4/PDA/PAMA-Arg 纳米复合微球材料
特异性不高，因此为了增强材料对目标磷酸化肽富
集的特异性,Xiong 等［21］制备了一种新的亲和材
料，在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA )修饰的
Fe 3O 4微球上引入胍基，通过简单调节上样溶液成
分，可以对全部磷酸化肽或仅对多磷酸化肽具有选择
性富集能力。该复合材料吸附容量大(200 mg/g ), 检测灵敏度高(0. 5 fmol )，富集回收率高 (91.30%)，特异性强，有利于低丰度磷酸化肽的检 测和鉴定。这种材料可以通过简单的调节溶剂梯度
选择性富集单、多磷酸化肽，为开发新型的富集材料 提供了新思路。
包塑轴承分子印迹聚合物(MIPs )因其稳定性高、制备简 单、可特异性识别、可重复使用等优势被越来越多地
用作富集材料。Emgenbroich 等［37］采用表位印迹
法设计了一种针对酪氨酸磷酸化肽的选择性印迹聚
合物受体，对酪氨酸磷酸化位点表现出良好的亲和 力，明显更易识别酪氨酸磷酸化肽而非丝氨酸磷酸 化肽。与抗体进一步对比，印迹聚合物能够捕获酪
氨酸磷酸化肽远多于非磷酸化肽和丝氨酸磷酸化
肽。Stefan 等［38］利用尿素单体与模板分子Fmoc-
pTyrOEt ，以物质的量比为2：1的条件，制备了一种 非印迹聚合物(NIP )，该聚合物与印迹聚合物完
全
相同，但省略了模板。该聚合物每个尿素基团都能
与磷酸根离子产生氢键，从而与pTyr 侧链的结合位
点紧密连接，结果显示该聚合物对相对分子质量较 低的酪氨酸磷酸化肽表现出很强的亲和力
。
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