附件1
水产品中孔雀石绿的快速检测
胶体金免疫层析法（KJ201701）
1 范围
本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐孔雀石绿总量的快速测定。
2 原理
样品中孔雀石绿、隐孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐孔雀石绿总 量进行定性判定。
3 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂
正己烷。
乙腈。
冰乙酸。
盐酸。
吐温-20。
氯化钠。
对-甲苯磺酸。
360历史
无水乙酸钠。
盐酸羟胺。
无水硫酸钠。
中性氧化铝：层析用，100目~200目。
二氯二氰基苯醌。
氯化钾。
磷酸二氢钾。
十二水合磷酸氢二钠。
饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200g，加水500mL，超声使其充分溶解。
盐酸羟胺溶液（0.25g/mL）：称取2.5g盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10mL，混匀。
二氧化钼乙酸盐缓冲液：称取4.95g无水乙酸钠（3.1.8）及0.95g对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950mL水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH为4.5，用水稀释至1L，混匀。
二氯二氰基苯醌溶液（0.001mol/L）：称取0.0227g二氯二氰基苯醌（3.1.12）置于100mL棕容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。4℃避光保存。垃圾分类器
复溶液：称取8.00g氯化钠（3.1.6），0.20g氯化钾（3.1.13），0.27g磷酸二氢钾（3.1.14）及2.87g十二水合磷酸氢二钠（3.1.15）溶解于900mL水中，加入0.5mL吐温-20（3.1.5），混匀，用盐酸（3.1.4）调节pH为7.4，用水稀释至1L，混匀。
3.2 参考物质
孔雀石绿、隐孔雀石绿参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥90%。
表1 孔雀石绿、隐孔雀石绿参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量
序号 | 中文名称 | 英文名称 | CAS登录号 | 分子式 | 相对分子质量 |
1 | 孔雀石绿 | MalachiteGreen | 569-64-2 | C23H25ClN2 | 364.91 |
2 | 隐孔雀石绿 | LeucomalachiteGreen | 129-73-7 | C23H26N2 | 330.47 |
| | | | | |
注：或等同可溯源物质。
3.3 dota重金属标准溶液配制
孔雀石绿、隐孔雀石绿标准储备液（1mg/mL）：精密称取适量孔雀石绿、隐孔雀石绿参考物质（3.2.1），分别置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为1mg/mL的孔雀石绿和隐孔雀石绿标准储备液。-20℃避光保存，有效期1个月。
孔雀石绿标准中间液A（1μg/mL）：精密量取孔雀石绿标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）0.1mL，置于100mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的孔雀石绿标准中间液A。临用新制。
孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）：精密量取孔雀石绿标准中间液A（1μg/mL）（3.3.2）1mL，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100ng/mL的孔雀石绿标准中间液B。临用新制。
隐孔雀石绿标准中间液A（1μg/mL）：精密量取隐孔雀石绿标准储备液（1mg/mL）
ts2
（3.3.1）0.1mL，置于100mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的隐孔雀石绿标准中间液A。临用新制。
隐孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）：精密量取隐孔雀石绿标准中间液A（1μg/mL）（3.3.4）1mL，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100ng/mL的隐孔雀石绿标准中间液B。临用新制。
3.4 材料
免疫胶体金试剂盒，适用基质为水产品或水。
3.4.1.1 金标微孔。
3.4.1.2 试纸条或检测卡。
4 仪器和设备
4.1 移液器：200µL、1mL和10mL。
4.2 涡旋混合器。
4.3 离心机：转速≥4000r/min。
4.4 电子天平：感量为0.01g。
4.5 氮吹浓缩仪。
4.6 环境条件：温度15℃—35℃，湿度≤80%。
5 分析步骤
5.1 试样制备
取适量有代表性样品的可食部分或养殖用水，固体样品充分粉碎混匀，液体样品需充分混匀。
5.2 试样的提取与净化
水产品
准确称取试样2g（精确至0.01g）置于15mL具塞离心管中，用红油性笔标记，依次加入
1mL饱和氯化钠溶液（3.1.16），0.2mL盐酸羟胺溶液（3.1.17），2mL乙酸盐缓冲液（3.1.18）及6mL乙腈（3.1.2），涡旋提取2min。加入1g无水硫酸钠（3.1.10），1g中性氧化铝（3.1.11），涡旋混合1min，以4600r/min离心5min。准确移取5mL上清液于15mL离心管中，加入1mL正已烷（3.1.1），充分混匀，以4600r/min食品烤箱离心1min。准确移取4mL下层液于15mL离心管中，加入100μL二氯二氰基苯醌溶液（3.1.19），涡旋混匀，反应1min，于55℃水浴中氮气吹干。精密加入200μL复溶液（3.1.20），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。
养殖用水
量取试样2mL置于离心管中，以4600r/min离心5min，移取200μL上清液作为待测液。
5.3 测定步骤
试纸条与金标微孔测定步骤
吸取全部样品待测液于金标微孔（3.4.1.1）中，抽吸5—10次使混合均匀，室温温育3—5min，将试纸条（3.4.1.2）吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育5—8min，从微孔
检测卡与金标微孔测定步骤
吸取全部样品待测液于金标微孔（3.4.1.1）中，抽吸5—10次使混合均匀，室温温育3—5min，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡（3.4.1.2）上的加样孔中，温育5—8min，进行结果判定。
5.4 质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
空白试验
称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
加标质控试验
5.4.1.1 水产品
准确称取空白试样2g或适量（精确至0.01g）置于15mL具塞离心管中，加入100μL或适量孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）（3.3.3），使孔雀石绿浓度为2μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
准确称取空白试样2g或适量（精确至0.01g）置于15mL具塞离心管中，加入100μL或适量隐孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）（3.3.5），使隐孔雀石绿浓度为2μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
5.4.1.2 养殖用水
准确量取空白试样2mL（精确至0.01g）置于15mL具塞离心管中，加入100μL孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）（3.3.3），使孔雀石绿浓度为2μg/L，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
6 结果判定要求
通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜深浅进行结果判定。目视判定示意图见图1。
6.1 无效
控制线（C线）不显，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
6.2 阳性结果
检测线（T线）不显或检测线（T线）颜比控制线（C线）颜浅，表明样品中孔雀石绿和隐孔雀石绿总量高于方法检测限，判定为阳性。
6.3 阴性结果
检测线（T线）颜比控制线（C线）颜深或者检测线（T线）颜与控制线（C线）颜相当，表明样品中孔雀石绿和隐孔雀石绿总量低于方法检测限，判定为阴性。
a)试纸条
b)检测卡
图1 目视判定示意图
6.4 质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。
7 结论
孔雀石绿和隐孔雀石绿总量以孔雀石绿计，当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。
8 性能指标
8.1 检测限：水产品2μg/kg，养殖用水2μg/L。
8.2 灵敏度：灵敏度应≥99%
8.3 特异性：特异性应≥85%。
8.4 假阴性率：假阴性率应≤1%。
8.5 假阳性率：假阳性率应≤15%。
注：性能指标计算方法见附录A。
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