胡静;张存政;郭逸蓉;梁晓;刘贤金;朱国念;刘凤权;王鸣华;王利民;华修德
【摘 要】建立了菊酯类农药广谱型免疫层析检测方法,可同时检测水果、蔬菜中12种、、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯农药残留。以粒径20 nm的胶体金标记羊抗小鼠IgG抗体于金标垫上,分别固定包被原(检测线,T线)、兔抗山羊 IgG 抗体(质控线, C 线)于硝酸纤维素膜( NC 膜)上,与吸水垫及聚氯乙烯( PVC)底板组合成层析试纸条。10 g样品经乙腈提取,PBS稀释4倍,取100μL与菊酯类农药的单克隆抗体混合后,直接用于试纸条检测。结果表明,试纸条对、、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯农药的裸眼观察检测灵敏度为0.5,5.0,5.0和5.0μg/mL,检测时长为8~10 min,采用QuEChERS方法,方法检测灵敏度可提高16倍。对蔬菜和水果的方法验证表明,除辣椒基质干扰呈假阳性外,其它样本的检测结果均与GC方法结果一致。试纸条采用金标羊抗小鼠IgG二抗的方法,使检测结果的重现性更好、更稳定,且抗基质干扰能力强,为菊酯类农药的累积毒性检测提供了新方法。%A monoclonal antibody based lateral flow immunoassay was developed for the simultaneous determination of four pyrethroid pesticides in vegetables and fruits, including fenpropathrin, cypermethrin, deltam ethrin, and cyhalothrin. The colloidal gold particles (20-nm) were prepared by the method of sodium citrate reduction and conjugated with goat anti-mice IgG. Antigen and rabbit anti-goat IgG were immobilized on the nitrocellulose membrane as the test line ( T line) and the control line ( C line) , separately. By sticking on PVC board, a gold immunochromatographic strip was assembled. About 10 g of samples was extracted by acetonitrile, and then diluted four times with PBS buffer. Anti-pyrethroid McAb was added in 100 μL of this extract solution for the antibody-antigen binding, thereafter, the mixture was ready for the strip testing. The results revealed that the test could be done within 10 min, and the cutoff values reached 0. 5, 5. 0, 5. 0, 5. 0 μg/mL for fenpropathrin, cypermethrin, deltamethrin, cyhalothrin, respectively. If the extraction going through QuEChERS method, the detection limit of method could be improved 16 times. Thereafter, the lateral flow immunoassay was employed for the verification test with 13 types of vegetables and fruits, except that the result of chillies presented the false positive result, the other results obtained higher consistency with the results of GC test. This new format of test strip using colloidal gold labeled goat anti-mice IgG as tracer, whi
ch could give more stable and repeatable results than classic test strip, would provide a new method for the simultaneous determination of four pyrethroid pesticides in vegetables and fruits.
【期刊名称】打点计时器《分析化学》
【年(卷),期】2016(044)012
【总页数】7页(P1900-1906)
【关键词】菊酯类农药;免疫层析试纸条;快速检测
【作 者】城乡信息一体化胡静;张存政;郭逸蓉;梁晓;刘贤金;朱国念;刘凤权;王鸣华;王利民;华修德
【作者单位】江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所，南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所，南京210014;浙江大学农药与环境毒理研究所，杭州310058;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所，南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所，南京210014;浙江大学农药与环境毒理研究所，杭州310058;江
苏省农业科学院植物保护研究所，南京210014;南京农业大学植物保护学院，南京210095;南京农业大学植物保护学院，南京210095;南京农业大学植物保护学院，南京210095
离子风机aryang【正文语种】中 文
拟除虫菊酯类(Pyrethroids)农药具有杀虫谱广、药效迅速、对光和热稳定、药效时间长等特点,在农业、林业、公共卫生等领域广泛使用[1～4],但其对生态系统及人类健康存在危害,尤其对蜜蜂及水生生物具有高毒性[5,6]。世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)对拟除虫菊酯类农药在蔬果上的残留制定了严格限量标准[4,7],我国也对该类农药制订了限量标准(GB 2763-2014)[8]。目前,菊酯类农药检测方法主要包括谱法、酶联免疫吸附法(ELISA)和其它生物分析方法。谱法主要包括气相谱(GC)、高效液相谱(HPLC)、质谱法(MS)及气相谱-质谱联用(GC-MS)或液相谱-质谱联用法(HPLC-MS)等[9～14]。仪器分析方法具有灵敏度高的优点,但费用较昂贵,技术要求高,不适用现场快速筛查大量样品[15]。基于抗原-抗体特异性反应的方法具有检测成本低、快速、高通量等优点,其中胶体金免疫层析技术,具有快速、简便、易判断等优点[16～18],适用于现场检测。
作为家族类化合物,多种菊酯农药在食品与环境中的累积毒性是严重的隐含风险,因此具有广
毛刷制作谱识别的抗体技术成为研究的重点。Wang等制备的广谱型单克隆抗体可以识别6种具有间苯氧基结构的菊酯类农药[19]。Takaho等获得的多克隆抗体可识别多种I型菊酯类农药,与II型菊酯类农药无交叉识别作用[20]。而Liang等建立的多克隆抗体免疫检测方法可同时识别多种II型菊酯类农药,与I型菊酯类农药无交叉识别作用[21]。但基于广谱型单克隆抗体的免疫层析试纸条的研究仍较少,Kranthi等[6]制备的多克隆抗体试纸条,对氯氰菊酯、、氰戊菊酯的检出限分别为800,1000和1400 ng/mL。本研究利用菊酯类农药广谱型单克隆抗体,改变传统胶体金标记一抗的方法,通过胶体金标记二抗的方法制备免疫层析试纸条,检测结果的重现性更好、更稳定,且抗基质干扰能力强,并实现了对12种代表性蔬菜水果样品中4种常用菊酯类农药的快速检测,为菊酯类农药累积毒性检测提供了新方法。
2.1 仪器与试剂
XYZ3050TM胶体金喷膜机(Bio-Dot公司);ZQ2000微电脑自动斩切机(上海金标生物科技有限公司);Lambda25 UV/VISspectrometer双光束紫外可见分光光度计(PerkinElmer公司);Multiscan ascent酶标仪(Thermo公司);硝酸纤维素膜(NC膜)、金标结合垫、吸水垫(美国Millipore公司);聚氯乙烯(PVC)底板、样品垫(上海金标科技生物有限公司);恒温振荡培养
箱(华利达实验设备有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏仪器设备有限公司);超纯水净化仪(Labconco公司)。
菊酯类农药标样(天津汇迪生物技术有限公司);菊酯类农药单克隆抗体及免疫原由本实验室及浙江大学研发[21];羊抗小鼠IgG、兔抗山羊IgG(博士德生物工程有限公司);牛血清蛋白(BSA,美国罗氏应用科技公司);氯金酸(HAuCl4·3H2O)、二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)(美国Sigma公司);其它试剂均为分析纯(西陇化工股份有限公司)。13种蔬菜水果购于当地超市。
2.2 胶体金制备与标记
2.2.1 胶体金制备与鉴定 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金:将200mL去离子水加入到500 mL广口玻璃瓶中,加入2%HAuCl4溶液1 mL(经0.22μm滤膜过滤),顺时针方向轻轻晃动至混匀后,放置于微波炉中高火加热5 min至沸腾;取出玻璃瓶,迅速顺时针方向轻轻晃动玻璃瓶,使瓶内溶液旋转后,快速加入1%柠檬酸三钠溶液4.8 mL(经0.22μm滤膜过滤),沿同一方向继续轻轻晃动玻璃瓶5 s,再次放入微波炉中高火加热4 min;取出玻璃瓶,此时瓶内酒红液体即为制备的胶体金溶液;室温自然冷却后,用去离子水定容至200 mL,混匀后4℃避光保存。用
紫外/可见分光光度计进行全波长扫描,测定所得胶体金在400～600 nm之间的最大吸收峰所在波长。采用透射电子显微镜(TEM)鉴定纳米金颗粒的大小和均一性。
2.2.2 pH值优化 向10个已加入1 mL胶体金的离心管中依次分别加入0,1,2,3,4,5,6,7,8和9μL 0.1 mol/L K2CO3调节pH值,混匀后,分别加入20μL羊抗小鼠IgG(1 mg/mL),混匀后静置2 h,观察,将未出现沉淀的溶液用酶标仪测其上清液的吸光度,吸光度最大的胶体金溶液所对应的K2CO3用量,即作为最佳pH值标记条件。
2.2.3 金标羊抗小鼠抗体的制备 (1)抗体最佳标记量的确定 取10个2 mL离心管,分别加入1 mL已调至最佳pH值的胶体金溶液,再依次加入0,1,2,3,4,5,6,7,8和9μL羊抗小鼠IgG (1 mg/mL),混匀后室温静置5 min,加入10%NaCl溶液100μL,5 min后观察并记录每管溶液颜变化,判断抗体最适标记量。(2)胶体金标记抗体 取50 mL胶体金溶液,用K2CO3(0.1 mol/L)溶液调节至最佳pH值,搅拌状态下缓慢加入最适量的羊抗小鼠IgG(1 mg/mL),搅拌30 min;加入10%BSA溶液使BSA终浓度为1%,继续搅拌30 min后,1500 r/min离心15min,取上清液继续以12000 r/min离心35 min后,弃去上清液,加入洗涤保存液(0.01%硼酸,0.2%PEG20000,0.02%NaN3)溶解沉淀至原体积;再以12000 r/min离心35 min后,弃去上清液,加入5 mL洗涤保存液溶解沉淀,即得金标羊抗小鼠二抗复合物,于4℃避光保存。
硒肥料
2.3 试纸条的组装和制备
2.3.1 试纸条组装 在金标结合垫上喷涂羊抗小鼠金标二抗复合物,37℃干燥2 h。将一定浓度的免疫原和兔抗山羊IgG包被在NC膜上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),37℃干燥2 h。将样品垫、金标结合垫、NC膜、吸水垫依次交叠1 mm贴于PVC底板上,临近金标结合垫为T线,临近吸水垫为C线,如图1所示。将组装好的试纸条压紧后用切条机将其切割宽度为3.5 mm的试纸条,28℃干燥条件下保存。
2.3.2 试纸条检测及结果判断 取100μL菊酯标准溶液(20%甲醇-PBS缓冲液稀释配制)或样品液与适量的菊酯单克隆抗体预混后加于样品垫中,(1)当待检样品含有小于该试纸最低检出限的菊酯农药时,溶液以毛细作用向上迁移溶解金标垫上的胶体金标记的羊抗小鼠二抗,单克隆抗体与之结合形成复合物,继续向上迁移到达检测线后,单克隆抗体与检测线上包被的免疫原结合,使金标二体与单克隆抗体形成的复合物在T线上沉积,形成肉眼可见的红,过量的金标二抗及其与单克隆抗体形成的复合物继续向上迁移,与C线上的兔抗山羊抗体结合,形成肉眼可见的红。当检测线颜等于或深于质控线,结果判断为阴性。(2)当待检样品含有大于或等于该试纸最低检出限的菊酯农药时,样品液中农药与单克隆抗体特异性结合,阻止了其与T
线上包被原的结合,使得单克隆抗体与金标羊抗鼠二抗形成的复合物无法在T线上形成沉淀,样品中菊酯含量越高,检测线颜越浅至无,胶体金标记的抗体及其复合物继续向上迁移到质控线,与C线上的兔抗山羊抗体结合,形成肉眼可见的红。此时T线颜变淡(浅于C线颜)或接近无,结果判断为阳性。(3)当C线没有颜时,无论T线是否有颜,均视为无效结果。检测时长8～10 min,结果判断如图2所示。
2.4 样品提取与前处理
2.4.1 有机溶剂选择 取10 g切碎的蔬菜、水果样品(洋葱、葱、生姜、大蒜、韭菜、小青菜、辣椒、胡萝卜、番茄、黄瓜、苹果、西瓜、大白菜)到50 mL玻璃瓶中,加入标样使添加浓度分别为0,2和4μg/mg(每个浓度做3个重复),静置30 min后,加入10 mL甲醇/乙腈/丙酮/20%甲醇-PBS溶液,振荡30min,过滤,取1 mL滤液用PBS溶液稀释4倍,用于试纸条检测。另取1 mL滤液,氮气吹干后,以正己烷定容,用于GC检测[23]。褥疮防治床垫
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议