介绍
试剂盒有10个重力流柱，而该柱在自然条件下纯化可重新装填Ni-IDA Sefinose TM 6 Fast Flow 和结合缓冲液，洗脱液。这10个柱子通过固定化金属亲和层析可用于纯化带组氨酸标签的蛋白。Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow 有很高的蛋白结合能力，低镍离子（Ni2 +）的泄漏以及可与变性剂和广泛的添加剂相兼容。澄清和非澄清的样品可使用该柱。特殊的frits在纯化过程可防止介质变干燥。一次纯化平均需要30分钟。在变性下纯化，请自备额外的结合缓冲液和洗脱液。 特征
柱材料 聚丙烯桶，聚乙烯筛板
介质 Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow
平均粒径 90 µm
蛋白结合能力 约6 mg组氨酸标签蛋白/1毫升树脂 床体积 1 mL/柱
使用时兼容性 在各种通用缓冲液，洗涤剂和变性剂中稳定
避免在缓冲液中 含螯合剂，例如EDTA，EGTA，柠檬酸等
pH稳定性，短期（2h） 2-14
储存 20%乙醇
保存温度 4或30℃
与NI-IDA树脂相兼容的试剂
还原试剂
5 mmol/L DTE(二硫赤藓糖醇)
5 mmol/L DTT(二硫苏糖醇)
20 mmol/L β-巯基乙醇
5 mmol/L TCEP(磷酸三氯乙酯)
10 mmol/L 还原型谷胱甘肽
变性剂
8 mol/L尿素
6 mol/L 盐酸胍
生铁铸造洗涤剂
2% TritonX-100(非离子物质)
2% Tween 20（非离子物质）
2% NP-40 (非离子物质)
2% 胆酸盐
1% CHAPS（两性离子）
其他添加剂
20% 乙醇
50% 甘油
100 mmol/L Na2SO4
threadx操作系统 1.5 mol/L NaCl
1 mmol/L EDTA
60 mmol/L柠檬酸盐
100 mmol/L 磷酸钠，pH 7.4
缓冲液
100 mmol/L Tris-HCl pH 7.4
100 mmol/L Tris pH 7.4
100 mmol/L HEPES pH 7.4
100 mmol/L MOPS pH 7.4
100 mmol/L 醋酸钠 pH 4
注意：
1.为了最佳的操作过程，按照上述纯化步骤进行预洗以除去任何削弱结合镍离子的物质。柱子不用时柱内不要留有缓冲液，因为该缓冲液内含还原剂。
2.由于需要保持较高粘度，所以在室温下使用。
3.通常螯合剂需谨慎使用（即仅在样品中而非缓冲液中使用）。任何金属离子的剥离可通过在离心/过滤样品前添加少量过量的MgCl2来抵消。
推荐使用的缓冲液
自然条件下
结合/洗涤液（含10 mmol/L 咪唑）： BSP030-3
洗脱液（含250 mmol/L 咪唑）：BSP030-4
变性条件下
结合/洗涤液：20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，pH 8.0
洗脱液 20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0
星空轮注意：样品和缓冲液中适当浓度的咪唑对获得最大的纯化是必需的，而且产量因蛋白而不尽相同。自然条件下，20-40 mmol/L 的咪唑的几盒缓冲液对许多蛋白已经足够。洗脱液中500 mmol/L 咪唑绝大多数情况下完全可洗下目的蛋白。
样品准备
自然条件下由大肠杆菌表达的含多聚组氨酸标签蛋白样品的准备（主要以可溶模式表达）。
1. 对于大肠杆菌表达的蛋白。稀释细胞团：家5-10毫升结合缓冲液稀释细胞团。样品和结合缓冲液需含同样浓度的咪唑以防止宿主细胞的蛋白与暴露的组氨酸结合。同时出去大颗粒和高浓度的试剂。例如，EDTA，组氨酸和柠檬酸，这些可破坏NI-IDA的树脂。
2. 酶法裂解：0.2 mg/ml 溶菌酶，20 µg/ml MgCl2（终浓度为1 mmol/L）, 1 mmol/L PMSF（苯）或其他蛋白抑制剂。这些抑制剂不能影响树脂的稳定性。然后4℃搅拌，30 min。
3. 机械裂解：超声，同质化，重复冻结/解冻，或其他类似技术。
4. 调整裂解液pH 至7.4：不要用强酸或强碱调pH （沉淀风险）
5. 离心裂解液，转移至管中室温下12000 rpm×20 min，或4℃下离心（根据蛋白灵敏度）。
6. 收集上清并进行纯化或/和手机包涵体沉淀以作进一步处理。
7. 对于通过酵母，昆虫或哺乳动物表达系统分泌到培养基的蛋白。若有大量上清，用硫酸铵沉淀收集蛋白，用1×PBS透析，然后装到柱中。如果上清不含那些会影响镍柱，例如EDTA，组氨酸等，则可直接使用柱子。对于细胞质中表达的蛋白，请使用其他商业试剂或试剂盒(such as BSP020 Insect Cell Protein Lysis Buffer, BSP022, Animal Cells Protein Lysis Buffer, BSP026 Yeast protein Lysis Buffer ) 或参考相关文献，然后通过将蛋白提取物和5倍体积结合/洗涤液混匀来准备样品。其他比例也可使用，但需要试验验证。
注意：你可将非澄清样品转至柱内（即省略上述步骤5），。如果是这样，延长机械裂解，例如超声10 min。总纯化时间将因非澄清样的较高粘度而增加。
变性条件下，聚组氨酸标签蛋白质样品的准备（主要在包涵体内表达）
1. 用1×PBS 重悬细胞沉淀（约5 mL/mL沉淀）。且按上述方法超声破碎细胞。
2. 离心裂解液收集包涵体，12000 rpm×10 min。如果有必要则用1×PBS洗几次包涵体。
3. 再结合/洗涤缓冲液中溶解包涵体（约5 mL/mL沉淀），并室温下孵育30-60 min，同质化或超声可助于充分溶解沉淀。
4. 12000 rpm×30 min以除去剩余不溶性物质，小心转移上清至干净管而不打散沉淀。
组氨酸标签重力纯化过程
每1 mL能处理的样品体积是10 mL。如果样品体积大于柱子的体积，则进行多次步骤知道所有样品流过柱子。小心不能超过柱子所能结合的能力。
1. 平衡柱到工作温度。在室温或4℃下完成纯化。
2. 取出底帽，移去顶帽。倒出多余的液体，夹住柱子并让其直立，使柱子的顶部朝上。
3. 将蛋白提取物和结合/洗涤液混匀，使总体积等于两个树脂床的体积。
4. 用两个树脂床体积的结合/洗涤液平衡柱子。按0.5-1 mL/min 的流速，让缓冲液从树脂中排出。
5. 加大肠杆菌裂解液或蛋白提取物和结合/洗涤液的混合物到树脂上方，收集流出物到管子。
6. 用两个树脂床体积的结合/洗涤液洗树脂并收集流出液。用新的管子重复这个步骤，直到流出物的吸光度在280 nm，接近基线。
7. 两个树脂床体积的结合/洗涤液从树脂上洗脱组氨酸标签蛋白。重复此步骤，用不同管子收集各组分。
8. 通过测量280 nm 下组分的吸光度或通过两种不同试剂盒监测蛋白洗脱。该洗脱蛋白可直接通过SDS-PAGE分析。
注意：用凝胶过滤或透析为后续试验移除咪唑（例如No BSP090 Gravity Desalting Column）。含6 mol/L 米胍盐酸的样品在 SDS-PAGE 分析前必须先用8 mol/L 尿素的缓冲液透析。
Cleaning-in-place protocol
如果观察到背压的上升或熟知的严重污染，则清洗过程必须进行。该过程通常是完全恢复性能的过程。由于镍柱树脂的高螯合能力和所产生的低金属浸出率。清洗前不需要stripping。我们推荐以下步骤取出污染物，如蛋白沉淀，疏水结合蛋白和脂蛋白。
步骤
1. 用15倍树脂床体积的0.5 mol/L NaOH洗墨盒。允许30 min的接触时间，并相应的调整流速。（例如洗1 mL镍柱，用0.5 mol/L NaOH，流速为0.5 mL/min，相应的总体积为15 mL）。
2. 用15倍树脂床体积的1×PBS重新平衡。此时墨盒可以使用了。将柱子储存于20-30%乙醇或10-100 mmol/L NaOH。
Regeneration by stripping and recharging（再生）
通常NI-IDA柱的stripping and recharging是没必要的。如果观察到背压和熟知的严重污染，通过清洗过程可恢复性能，但是如果行能还不够令人满意，NI-IDA的树脂可用以下步骤进行stripping and recharging。
1. 用stripping缓冲液（50 mmol/L 钠磷酸盐； 300 mmol/L NaCl； 100 mmol/L EDTA；pH 8.0）
2. 用20倍树脂床体积的去离子水洗树脂。
3. 通过装2倍树脂床体积的100 mmol/L NiSO4 (用去离子水配) 来重装水洗柱。
4. 用10倍树脂床体积的去离子水洗，并用10倍树脂床体积的1×PBS 重新平衡。现在柱子已经可用。在20-30 %乙醇或10-100 mmol/L NaOH中储存柱子。
排除方法
问题 | 可能的原因 | 建议 |
流出速率太低 | 样品太粘稠 | 1.如果在4℃下纯化已完成，则可能的话转至室温。 2.超声前增加细胞团的稀释度或超声后稀释细胞团 连通域3.继续超声知道粘度降低，且/或家额外的DNA酶和Mg2+ 4.过滤样品（或如果非澄清样已使用则离心） 5.如果使用了非常粘稠的溶液，则将柱子连到真空歧管以加速流速 |
纯化过程，靶蛋白难溶或沉淀 | 1.加洗涤剂或其他添加剂并轻轻混匀30 min以助于靶蛋白的溶解。注意到Triton X-100和NP-40在280 nm处有很高的吸光度，而且洗涤剂不能轻易用缓冲液去除。 2.包涵体：用普通的变性剂，例如4-6 mol/L盐酸胍，4-8 mol/L尿素或强洗涤剂可使蛋白从包涵体中溶解出（并展开），轻轻混匀30 min或更长以助于靶蛋白的溶解 |
穿管器组氨酸标签蛋白产量低 | 组氨酸标签蛋白未完全洗脱 | 多用几 mL洗脱液洗脱 |
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