时间机器在吱吱嘎嘎地慢行……
瓶瓶罐罐在咣咣当当地交叉轮回……
一切在步骤中井然有序……
最后终于等到关键性检测奇迹发生的时刻了，实验做到这里，总归一个周期，理想的结果要衷心的祝贺了，意外的或者没结果的，先收拾一下失落的不开心，下一步里的反思或许是一个新的开始……
生物日记部落里有哪些可供选择的蛋白纯化检测的方法呢？在此汇总了常规的蛋白纯化的基本方法，供需要的实验阁伙伴们浏览参考，欢迎常来这里做客。
——结果处现的那刻，某君心情怎样？
好与不好会相对
那么，高兴与不高兴会有阶段性
很努力很努力就好
（1）Western-blot
Western Blot技术广泛的应用于蛋白质纯化和表达水平的鉴定，其可以特异性检测目标蛋白，又可以半定量检测目的蛋白的含量。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。固相载体上吸附的蛋白质或多肽作为抗原，利用一抗特异性吸附目的蛋白，与辣根过氧化物酶或同位素标记的二抗与一抗起反应，经过底物显或放射自显影技术检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
（2）酶联免疫吸附法ELISA
利用抗原与抗体特异性吸附的免疫学原理，将具有免疫活性的抗原（抗体）结合在固相载体上，与酶偶联的抗体（抗原）能够与载体上的抗原（抗体）特异性结合，加入酶的底物，底物与酶发生催化水解或者氧化还原反应而呈颜反应，颜的深浅与加样的抗原（
抗体）含量成正比。利用分光光度计（酶标仪）测定蛋白的含量，其方法简单，特异性强。
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2、最常用的蛋白质含量的测定方法
考马斯亮蓝法、Bradford法、Bicinchoninic acid （BCA ）法、金属工艺品制作紫外分光光度法、凯氏定氮法。
BCA方法、Lowery法是常用的蛋白质定量测定的方法，其原理相似，在碱性环境下蛋白质络合Cu2+， 还原Cu2+vlanid形成Cu1+。BCA试剂与Cu1+结合形成稳定的紫蓝复合物，利用紫外分光光度计测定该复合物在562 nM处的光吸收值，吸光值越高，蛋白质的浓度越大，
利用已知蛋白浓度的样品测定对应的吸光值，绘制标准曲线，据此测定目标蛋白质的浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，形成的蓝复合物稳定性好，并且受干扰物质影响小。
3、蛋白分子量的测定方法
（1）SDS-PAGE法、
聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）是由单体丙烯酰胺（双刀双掷Acr）、交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）、加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（简称TEMED）、催化剂过硫酸铵（简称AP）相互聚合交联形成的三维网状结构凝胶。
SDS是一种变性剂和阴离子去污剂。作为变性剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，辅助加入强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂，破坏蛋白分子的二、三级结构。
作为阴离子去污剂，加入SDS后，解聚后的多肽链氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样，在样品和凝胶中加入SDS试剂和还原剂就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，从而达到通过分子量差异分离蛋白的目的。
（2）凝胶过滤层析法、质谱是最精确的测量蛋白分子量的方法；
凝胶过滤层析又称为分子筛层析、凝胶渗透层析等，是一种按照样品组分中分子的大小进
行样品分离的液相谱方法。固定相如琼脂糖、聚丙烯酰胺等，具有分子筛的作用，以惰性的葡聚糖凝胶作为柱填料应用最广泛，凝胶颗粒为珠状、形成很多孔穴的立体网状结构。流动相为样品溶液，流动相组分中分子的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
GST、His标签蛋白常见的检测方法应用：
1、GST标签蛋白检测方法
（1）GST96 孔检测模板：利用ELISA酶联免疫特异性吸附分析检测纯化的蛋白样品和中间组分是否含有GST标签蛋白。
固定在每个孔壁上的抗GST抗体特异性吸附GST标签蛋白，空用洗涤缓冲液洗涤去除未结合的杂蛋白，然后，加入辣根过氧化物酶标记的抗GST抗体复合物温浴，加入TMB底物，测定每孔在450 nm处的吸光值检测气泡包装膜GST标签蛋白。
（2）CDNB酶活检测GST
GST酶的底物CDNB和谷胱甘肽反应生成产物，利用酶标仪或者紫外、可见光分光光度计检测产物在340 nm处的吸光值。
（3）Western-blot分析
蛋白免疫印迹检测和全蛋白的SDS-PAGE染法为纯化结果提供强有力的对照。
Western-blot 分析方法可以检测GST标签蛋白的表达和纯化，选取抗GST的抗体（山羊多抗）作为一抗特异性结合GST标签蛋白， 加入GST抗体的二抗（如HRP偶联的抗山羊抗体）孵育，加入网络墓地ECL试剂提高检测的灵敏度。
2、His组氨酸标签蛋白检测
（1）针对目的蛋白特异的检测方法采用SDS-PAGE考马斯染检测蛋白表达纯化结果。
（2）ELISA酶联免疫特异性吸附：抗His标签抗体进行ELISA反应；
（3）Western-blot：抗His标签抗体和ECL试剂进行蛋白免疫印迹反应。
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