注意事项：1.第一次使用前在漂洗液WB和去蛋白液中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标志加入乙醇，以免多次加入！
2.将RNaseA全部加入溶液1中，混匀，每次使用后置于2-8°C保存。
3.将溶液P3放在冰上预冷，可以提高产量
操作步骤
1.取1.5-4.5ml过夜培养的菌液，9000rpm离心30s，尽可能倒干上清，收集菌体。
收集超过1.5ml菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集足够的菌体。
2.用250ul溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
3.加入250ul的溶液P2，温和地上下翻转4-7次是菌体充分裂解， 室温放置4分钟。
4.加350ul溶液P3，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀时会出现白素状沉淀，13000rpm离心10分钟，小心取上清。
5.将上一步所得上清加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管)，13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。
可选步骤：加入500ul去蛋白液PE，13000rpm离心30-60s，弃废液。此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株XL-1 Blue 和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可忽略过此步骤。
6.加入500ul漂洗液WB(检查是否加入了无水乙醇)，12000rpm，离心30s，弃掉废液。
7.加入500ul漂洗液WB，12000rpm，离心30S，弃掉废液。
8.将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm，离心两分钟，尽量去除漂洗液，以免漂洗液中残存乙醇抑制下游反应。
9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，室温放置10分钟。
烘干机组10.在吸附柱中间部位加入50ul洗脱液EB（洗脱缓冲液事先在65-70°C水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应小于50ul，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。
测序
感受态制备
试剂准备：0.1M Cacl2 过滤除菌；0.1MCacl2+15%丙三醇（高压灭菌）
1.平板划线(无抗生素)37°过夜培养
2.挑单菌落+5mlLB(无抗生素)，37°C，180rpm过夜培养
3.5ml过夜菌+150ml LB培养基，37C °180 rpm，培养至OD到0.8-1.0
4.分装到50ml/管(超净工作台)，冰上放置15min
5.4000rpm，10min，4°C弃上清
6.50ml沉淀用10ml 0.1M Cacl2 重悬，冰上放30min，收为一管
7.4000rpm，10min，4°C弃上清
8.总5ml(0.1 MCacl2 +15%甘油)/150ml 菌液重悬
9.分装500ul /管，液氮速冻后放-80°C保存
注意事项
①低温，全程在冰盒上操作上完成
②动作轻柔，用头轻轻搅拌混匀，不要用头吹打或涡旋器振荡
③检测是否制备成功的方法：用抗性质粒转化感受态，看是否能在相应的抗性平板上长出单菌落
④使用超净工作台进行无菌操作
试表达
1.挑取BL21平板上单菌落于含抗生素抗性的100ml LB培养基中，37°过夜培养12小时
2.菌液摇到一定浓度后，调节温度让菌体到16°C，加入终浓度为200-300mM的IPTG诱导16-20小时
3.收集菌液至50ml离心管，3200rpm，离心30min、
4.取30,ul新鲜beads到1.5ul的EP管，用水洗3次，3000rpm，2min，再用裂解buffer洗一次
5.吸尽上清，用3ml裂解buffer 重悬，取1.5ml至EP管，超声破碎，“3s 6s 75w”’，3min待液体至澄清
6. 4°C，18000rpm，离心30min，取上清样和beads样
7.将上清结合到beads上，充分混匀后，4°C搅拌60min
8.吸尽上清，用裂解buffer洗3次，取beads样
9.SDS-蛋白电泳
大量表达
1.挑取BL21上的单克隆于100ml LB培养基中，37°过夜培养12h
镀铬工艺2.过夜后菌液到一定浓度，100ml菌液分到3个800ml的LB培养基中，培养至一定浓度后用终浓度为200-300nM IPTG诱导16-20h
3.菌液收集，3200rpm，离心30min
4.加入200-300ml裂解buffer 重悬菌体，用高压破碎仪破碎3次
5.18000rpm，4°，离心30min
6.取上清与处理好的beads结合，4°搅拌1h
钍燃料7.3200rpm，4°，2min离心，弃上清，用裂解buffer重复3次
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