基础⽣化实验-蛋⽩质纯化
蛋⽩质纯化
⼀、⽬的:
利⽤⾦属亲和性管柱(metal affinity column)来⼤量纯化带有affinity tag的基因重组蛋⽩。
⼆、原理:
由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利⽤基因重组技术在表现的蛋⽩质加上His Tag，再以⾦属亲和性管柱
(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带⼆价正电的阳离⼦相螯和)及liquid chromatography来⼤量纯化蛋⽩质。
三、试剂与器材:
1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl
Ph7)
细菌回溶成为蛋⽩质的载体以保持活性
2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)
3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)
上课补充:
蛋⽩质很脆弱，需要在特殊的buffer⾥。
四、仪器与设备:
FPLC(速液相⾊谱仪)
五、步骤:
1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。
2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注⼊蛋⽩质样本。
空调用制冷技术
3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。
4.⽤wash buffer和elution buffer进⾏线性梳洗，并收集流出液体，以
FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之
曲
线图。
上课补充:
胞内型分泌需要⽤超⾳波破菌，因为会放热所以要放在冰中使⽤。
线性梳洗为加⼊elution buffer会有颜⾊变化会把镍离⼦跟imidazole冲
洗掉，剩下胶体溶液。
其中imidazole和Histidine类似也会和镍离⼦结合所以会竞争，可拿来 洗涤蛋⽩质。(可详见问题⼀及补充资料2)
六、问题:
问题⼀: Imidazole的结构与特性。
Imidazole⼜名咪唑即1,3-⼆氮唑，是⼀个五元杂环芳⾹性有机化合物，化学式C3H4N2。它也是⼀个⽣物碱。⽩⾊或浅黄⾊固
醇、醚，具有酸性，也具有碱性。氢原⼦在两个氮原⼦之间移动，因此存在两个互变异构体。
咪唑环结构在⽣物分⼦中⼴泛存在，例如组氨酸和对应的荷尔蒙组胺。很多药物也包含有咪唑环，例如硝基咪唑和咪唑类抗真菌药物。
结构与性质
咪唑为平⾯五元环状化合物，易溶于⽔（以⽆限⽐例）和其它极性溶剂。咪
唑的两个氮原⼦间存在永久偶极，极性很强，偶极矩为3.61D，并且分⼦间存在氢键缔合，导致了咪唑具有反常⾼的沸点（256°C）。分⼦中存在⼀个6电⼦
共轭⼤π键，故具有典型的芳⾹性。与氢以σ键相连的氮原⼦提供⼀对电⼦，环内其余四个原⼦各提供⼀个电⼦成键。
1N上有氢的咪唑环中，氢原⼦可以在两个氮原⼦间迁移，存在两个互变异构体，C-4和C-5是等同的。这两个互变异构体⽆法分离，当有取代基时，常以「4(5)-取代咪唑」（如4(5)-甲基咪唑）来命名。
组氨酸⽣成组胺的反应如下所⽰：
咪唑⼀个⽤途是在⾦属螯合亲和层析(IMAC)中⽤于His标签蛋⽩的纯化。
标签蛋⽩与层析柱表⾯珠孔内的镍离⼦介质发⽣结合，过量的咪唑通过层析柱，将与镍配位的标签蛋⽩洗脱下来，得到⾼纯度的⽬标蛋⽩。
咪唑是许多药品的重要组成部分。许多杀菌剂和抗真菌、抗原⾍和抗⾼⾎压的药物中含有合成咪唑。咪唑是茶叶和咖啡⾖中含有的茶碱分⼦的组成部分，具
有刺激中枢神经系统的作⽤。通过⼲扰DNA的活动抑制⽩⾎病的抗癌药物巯嘌
呤中也含有咪唑。
问题⼆:2.ETDA的资料(整理)
EDTA⼜名⼄⼆胺四⼄酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
简称：EDTA
俗名；依地酸（特别是它的钙盐络合物，医学上称为依地酸钠钙）
分⼦量：292.248
分⼦式：C10H16N2O8
为⽩⾊⽆臭⽆味、⽆⾊结晶性粉末，熔点240℃(分解)。不溶于冷⽔、醇及⼀般有机溶剂，微溶于热⽔，溶于氢氧化钠，碳酸钠及氨的溶液中，能溶于160份100℃沸⽔。为⼀种有机化合物。它是⼀个六齿配体，可以螯着多种⾦属离⼦。它的4个酸和2个胺的部分都可作为配体的齿，与锰（II）、铜（II）、铁（III）及钴（III）等⾦属离⼦组成螯合物 化学家曾经⽤多种不同的字来形容EDTA，例如将配体本⾝叫做EDTA4?，⽽它的共轭酸叫做H4EDTA。
配合物
EDTA和⾦属的螯合物，EDTA 和其他化合物如H2IDA（亚胺基⼆⼄酸）和H3NTA（氨三⼄酸）等属于同类的螯合物，这些配体都是由⼀种叫做⽢氨酸的胺
基酸制成的。EDTA类的螯合物都极易溶于⽔。这些配体都为三或四齿配体，⽽合成出来的螯合物都是光学异构物。
⽤途
在1999年欧洲EDTA年消耗量为35,000吨，在美国为50,000吨，其重要的⽤途如下：
⼯业：清理重⾦属离⼦及Ca2+和Mg2+离⼦。
肥皂：与硬⽔中的Ca2+和Mg2+离⼦结合来降低硬度。
摄影：以Fe(III)EDTA作为氧化剂。
纺织品：与重⾦属结合。
⾷物：作为防腐剂来避免重⾦属的氧化。
化妆品：加上EDTA 来保存化妆品。
油⽣产：加上EDTA 来防⽌矿物沈淀。
⽜奶：清洗⽜奶瓶。
氮氧化物：废⽓的处理。
⽣物医学：
o汞毒：使⽤EDTA的⼆钠钙盐-⼄⼆胺四⼄酸⼆钠钙[3]（EDTA Na2-Ca）重⾦属中毒。可汞中毒的⼈，也可铅中毒
的⼈。利⽤EDTA与重⾦属结合的特性，⽣成穏定⽽可溶的盐，
随尿液排出。
o检验医学：作为⾎液等液体类标本的抗凝剂（如全⾎细胞计数时所采⽤的⾎液标本）。
o⽛医学：在根管术中⽤来清除⼀些有机或⽆机的物质。
聚氨酯浆料
o⽣物化学：在分⼦⽣物学中⽤EDTA 来防⽌⾦属离⼦对酶的影响
防过敏皮带[4]。
汽⽔：汽⽔中含有的维⽣素C和苯甲酸钠有机会产⽣致癌物质苯，可以EDTA来处理。
⽔的测试：测试⽔的硬度。
环境问题
EDTA 不能在污⽔处理中被分解，不过在控制着pH值的情况下，经长时间后EDTA 就会⼏乎完全反应了，当其时要将其他微⽣物抽离，来让EDTA 完成结合的过程。在⽔中，太多或太少的螯合物都会影响浮游⽣物和藻类的数量，可以是增加或者减少。EDTA 对细菌来说是有毒的，在哺乳类动物的粪便中会破坏⽣物的细胞膜。
问题三:Tris-HCL是甚么?
答:Tris-HCl是三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的英⽂名称的缩写, ⽤作⽣物缓冲剂，添加剂英⽂名Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride
别名2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol hydrochloride; Tromethane
hydrochloride; Trizma hydrochloride
别名:2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙⼆醇盐酸盐
曲轴设计
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐分⼦式:C4H11NO3.HCl
硝化纤维素膜
分⼦量:157.59
物理化学性质熔点:150-152°C
为⽔溶性SOLUBLE
锚垫板结构式:
pKa ( 25℃ ):pH ( 0.5M in water ) 3.5 ~ 5.0
问题四：为何使⽤UV波长为280 nm?
答:⼀般有机物质，对于波长在250 nm 以下的光才有吸收作⽤，但含有苯环的胺基酸(aromatic amino acids)，对于波长250 nm 以上的光却有吸收作⽤。凡含有此等胺基酸的蛋⽩质，其⽔溶液对于波长在260 nm⾄290 nm (通常取280 nm波长)之光，均有吸收作⽤，其吸收量与蛋⽩质溶液的浓度成正⽐。所以含有phenylalanine、tyrosine或tryptophan的蛋⽩质，均可采⽤此
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