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韦林洪;刘琳;吕红映;滕镇远;康慧敏;王赪胤;胡效亚
【摘 要】采用循环伏安法在丝网印刷碳电极表面电聚合聚苯胺/壳聚糖复合膜,利用静电吸附作用固定烯效唑抗体,制备了检测烯效唑的阻抗型免疫传感器.采用循环伏安法和电化学阻抗谱对电极修饰过程进行了表征,并考察了缓冲溶液pH值、温育温度及时间对免疫反应的影响.在优化的条件下研究了免疫传感器的性能.此免疫传感器具有灵敏度高、特异性强、重现性和稳定性好的特点,对烯效唑的线性检测范围为0.01 ～100 mg/L,相关系数为0.999,检出限为8μg/L(3σ).白菜样品中添加0.05,0.10和1.0 mg/kg烯效唑,平均回收率为98.5％ ～ 104.6％,相对标准偏差为3.3％ ～4.3％,检测结果与气相谱法的检测结果相符.
【期刊名称】《分析化学》
骑行者【年(卷),期】2016(044)002
【总页数】7页(P258-264)
【关键词】免疫传感器;电化学阻抗谱;烯效唑;丝网印刷电极
【作 者】韦林洪;刘琳;吕红映;滕镇远;康慧敏;王赪胤;胡效亚
【作者单位】扬州大学化学化工学院,江苏省环境材料与环境工程重点实验室,扬州225002;扬州职业大学生物与化工工程学院,扬州225009;扬州大学化学化工学院,江苏省环境材料与环境工程重点实验室,扬州225002;扬州大学化学化工学院,江苏省环境材料与环境工程重点实验室,扬州225002;扬州大学化学化工学院,江苏省环境材料与环境工程重点实验室,扬州225002;扬州大学化学化工学院,江苏省环境材料与环境工程重点实验室,扬州225002;扬州大学化学化工学院,江苏省环境材料与环境工程重点实验室,扬州225002;扬州大学化学化工学院,江苏省环境材料与环境工程重点实验室,扬州225002
【正文语种】中 文冷却水循环
烯效唑（Uniconazole）是20世纪80年代推出的一种高活性植物生长延缓剂和杀菌剂，广泛用于果树、蔬菜和大田作物等，以提高其品质和质量［1］，但由此导致的药物残留问题引起了人们的关注。日本肯定列表中规定烯效唑的最大残留限量（MRL）为0.01 mg/kg［2］，我国《食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量》（GB 2763-2012）［3］规定糙米和小麦、花生仁、油菜籽中烯效唑的MRL分别为0.1和0.05 mg/kg。目前烯效唑残留
检测研究较少，还没有国家标准方法。因此，建立烯唑残留检测方法对于保护环境和农产品质量安全具有重要意义。
常用的烯效唑残留检测方法主要有高效液相谱法（HPLC）［4］、液相谱-质谱法（HPLC-MS）［2，5］、气相谱法（GC）［6］等。烯效唑及中间体相对分子质量较大、极性较强，采用GC分析时气化温度高，保留时间长，准确度差，但灵敏度高［7］。HPLC准确度、稳定性好，但灵敏度比GC稍低。HPLC-MS具有高特异性和高灵敏度，是目前广泛应用的方法［8］。但上述方法需要昂贵的仪器和专业的操作人员，对样品前处理要求高，分析时间长。张良等［9］建立了直接竞争酶联免疫分析法（dc-ELISA）测定苹果中的烯效唑，该法特异性强、灵敏度高、样品前处理简单，但需要对半抗原进行标记，且样品基质、操作等因素会影响测定结果，易产生假阳性。因此，有必要建立简便、快速、灵敏、特异性强的烯效唑检测方法。
电化学免疫传感器具有响应速度快、灵敏度高、特异性强、测定时不受样品溶液颜和浊度等因素的影响、携带方便等特点，是目前残留分析技术的研究热点。但常见的金电极、铂电极和玻碳电极等价格较高，使用前需预处理，一旦损坏很难再生［10］。近年来，基
支脚>系船柱于丝网印刷电极构建的免疫传感器较好地解决了这些问题。丝网印刷电极（Screen-printed electrode，SPE）是集工作电极、参比电极、辅助电极为一体的可一次性使用的电极，具有制作简便、可批量生产、成本低、便于携带、操作方便、样品用量少等优点，避免了共用同一电极检测多个样本时的交叉干扰问题［11］，广泛用于环境监测［12］、医疗诊断［13］和食品安全检测［14］。
本研究利用聚苯胺的导电性和壳聚糖的生物相容性，在丝网印刷碳电极（SPCE）表面修饰聚苯胺/壳聚糖（PANI/CS）复合膜，通过静电吸附作用固定抗体，制备了检测烯效唑的阻抗型免疫传感器，并成功用于白菜样品的检测。目前，尚未见电化学免疫传感器用于烯效唑检测的文献报道。
2.1 仪器与试剂
Autolab PGSTAT30电化学工作站（荷兰Ecochemie公司）；CHI832B电化学工作站（上海辰华仪器公司）；丝网印刷碳电极（SPCE，工作电极直径4 mm，工作电极和辅助电极为碳电极，参比电极为Ag/AgCl电极，西班牙 DropSens公司）；KQ-50DA超声波清洗机（昆山超声波清洗机有限公司）；AR2140电子天平（德国梅特勒-托利多公司）；GC201
0气相谱仪（日本岛津公司），配ECD检测器；Mixplus涡旋混合器（合肥艾本森公司）；HGC-12D氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）。
烯效唑单克隆抗体（Ab）由扬州大学环境科学工程学院提供；烯效唑（纯度92%，江苏七洲绿化工股份有限公司）；壳聚糖（CS，分子量为20万，脱乙酰度95%（国药集团化学试剂有限公司）；卵清蛋白（OVA，生物纯，西安生物有限公司）；其它试剂均为分析纯；0.02 mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液（PBS）；实验用水均为超纯水（18.2 MΩ cm，Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司）。白菜购于当地市场。
2.2 免疫传感器的制备
2.2.1 聚苯胺/壳聚糖膜的制备［15］将10 mL 0.2 mol/L苯胺溶液（1.9 mL苯胺，加100 mL 1 mol/L HCl溶解）与10 mL，0.1% 壳聚糖溶液（0.1 g壳聚糖溶于2 mL 0.05 mol/L pH 5的醋酸缓冲液，用超纯水稀释至100 mL）混合，超声分散2 h，得到分散均匀的悬浊液。取15 μL分散均匀的苯胺/壳聚糖溶液滴在SPCE表面，以50 mV/s的速率在-0.2～0.9V循环扫描15圈，用超纯水清洗电极，室温下晾干，得到PANI/CS/SPCE电极。
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2.2.2 烯效唑免疫传感器的制备在PANI/CS/SPCE表面滴加0.5 mg/mL烯效唑抗体溶液10 μL，4℃放置12 h后用超纯水洗涤，得到Ab/PANI/CS/SPCE电极，在其表面滴加5 mg/mL OVA溶液10 μL，37.5℃温育30 min，用超纯水清洗，制得免疫传感器（OVA/Ab/PANI/CS/SPCE），4℃保存备用。
2.3 交流阻抗的测量在免疫传感器工作电极表面加入10 μL不同浓度烯效唑标准溶液或样品溶液，37.5℃下温育90 min，取出依次用0.02 mol/L PBS（pH 7.0）和超纯水洗涤。在含有0.2 mol/L KCl的5 mmol/L K3［Fe（CN）］6/K4［Fe（CN）6］溶液中测定电化学阻抗谱，频率范围0.1～105Hz，使用开路电位，正弦波电位的振幅为10 mV。
免疫反应前后阻抗的相对变化值（ΔRct）按下列公式计算：
其中，Rct（Ag-Ab）是烯效唑与烯效唑单克隆抗体结合后的阻抗值；Rct（Ab）是烯效唑抗体固定在电极表面后的阻抗值。
2.4 实际样品的制备
准确称取10 g粉碎的白菜样品于50 mL离心管中，加入20.0 mL乙腈，于涡旋振荡器上高速
（2500 r/min）振荡2 min，过滤，收集滤液至装有5 g NaCl的50 mL具塞量筒中，剧烈振荡1 min，室温下静置15 min，使乙腈相和水相分层。移取10 mL乙腈相于20 mL刻度试管中，用氮气吹至近干，用丙酮定容至1.0 mL，备用。
2.5 气相谱条件［7］
谱柱：HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）。程序升温：初始温度120℃，保持2 min；以6℃/min升至300℃，保持5 min。进样口温度：260℃；检测器温度：320℃ ；流速：1.0 mL/min，尾吹：30 mL/min；进样量：1 μL；进样方式：不分流进样。
3.1 免疫传感器制备与检测原理
免疫传感器的制备及检测原理如图1所示。首先在SPCE表面通过循环伏安法将苯胺电聚合生成聚苯胺（PANI）薄膜，同时CS被包裹其中形成PANI/CS复合膜。该复合膜富含氨基、成膜性好，在电极表面具有良好的粘附性。利用抗体与复合膜之间的静电吸附作用将抗体固定到电极表面［16］，然后用OVA封闭PANI/CS复合膜上未吸附抗体的活性位点。检测时，烯效唑与电极表面的抗体反应形成免疫复合物，阻碍了探针分子和SPCE表面的电子转移，阻抗值变大，免疫反应前后阻抗的相对变化值（ΔRct）与样品含量呈正相关。
3.2 免疫传感器的电化学特性
3.2.1 循环伏安法（CV）表征免疫传感器的电化学特性利用CV表征丝网印刷电极每一步修饰后的电化学特性，如图2A所示。裸电极（曲线a）显示了一对可逆性良好的氧化还原峰；当PANI/CS复合膜修饰到SPCE表面后，氧化还原峰电流有所降低（曲线b），这是由于PANI/CS复合膜抑制了电子转移；当电极表面固定抗体、封闭OVA、烯效唑抗原与抗体的结合后，电极表面绝缘层逐渐增厚，如图2A中曲线c，d，e所示，电极的氧化还原峰电流逐渐下降。以上结果表明，固定在电极表面的抗体和形成的免疫反应复合物有效地封闭电极表面，抑制氧化还原探针和电极间的电子传递。
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