•医学检验・医用耦合剂薄膜过滤法检验微生物方法学验证 李喜梅
医用耦合剂是临床各类黑白或彩超声诊断和操作的透射介质，由丙烯酸树脂(卡波姆)、甘油和纯化水和消 毒剂组成。卡波姆为水性高分子凝胶制剂，在制备及贮存过程中，由于其水性特征，极易染菌，容易给机体引入病原性微生物。所以，超声耦合剂的质量标准中制定了微生物限度指 标加以控制。由于其含有消毒剂，在检验其所含微生物时，首先应消除卡波姆黏稠不易通过滤膜及消毒剂抑菌性影响％本文主要论述含盐酸聚六亚甲基胍消毒剂的超声耦合剂的微生物检验方法的建立。
1实验前准备&1,2'
1.1仪器器具：智能集菌仪、生化培养箱、高压蒸气灭菌器、电子天平等。
实验用菌种和培养基：金黄葡萄球菌&CMCC(B) 26003)］、铜绿假单胞菌&CMCC(B)10104］、枯草芽抱杆菌［CMCC(B)63501］、白念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉菌［CMCC(F)98003］，来源于中国食品药品检定研究院。沙氏葡萄糖培养基、溴化十六烷基甲基琼脂培养、氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨液体培养基等来自北京三药科技开发公司。
1.2实验用试剂：吐温80，卵磷脂,10%氯化钙。
1.3菌液制备：分别取金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱菌传代次数3代的菌种的新鲜培养物，用胰酪大豆胨液体制成适宜浓度的菌悬液，30~354培养18~24h，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数1.0: 104~
2.0x104cfu的菌液。白念珠菌3代新鲜培养物接种到沙氏葡萄糖琼脂培养基中,20~25@培养24~48h,pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数1.0x104~2.0x104 cfu；取黑曲霉的新鲜培养物加入5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将抱子洗脱，再同法制成每ml不大于1.0x104~2.0x104cfu菌液备用。同时继续稀释各菌液成含50~100cfu/ml的菌液备用
2实验方法和实验过程
2.1中和剂系统适用性验证
2.1.1中和剂配制方法：在100ml普通营养肉汤中加入已灭菌处理的2.5g吐温80和2.0g的卵磷脂，混合均匀。取95 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，边搅拌边加已灭菌处理的10%氯化钙溶液约5mL，加入100mL上述无菌中和
DOI：10.11655/zgywylc2021.07.074
作者单位：030001太原，山西省医疗器械检测中心业务科剂，加入上述5种1ml含菌量1.0x104~2.0x1
04cfu菌液混合均匀。同时用95ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制备含菌量50~100cfu的菌液备用。
2.1.2试验组：取2.1.1供试液上清液1ml注入平皿中，分别对应倾入45@熔化的胰酪大豆琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂，倒置培养，胰酪大豆琼脂培养基30~35@培养3~5d，沙氏葡萄糖琼脂培养基20~25@培养5~7d，点计菌数，各试验菌同法操作。
2.1.3菌液组：取上述含菌量的菌液1ml分别注入200ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀。取1ml注入平皿，同2.1.2方法进行培养计数。
2.1.4供试品对照组：按2.1.2方法，不加菌液，测试中和剂系统本底菌数。
上述试验进行3次独立平行试验，计算3次实验的回收 率，见表1%
2.1.6从在3次独立平行实验中，由表1可知，中和剂对照组的菌数与菌液对照组的菌落数比值在0.5~2的范围内％说明，加入此种中和剂对微生物生长影响不大％
2.2供试品细菌、霉菌计数方法验证
2.2.1供试液制备：取供试品20g加入到装有约75ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角瓶中，边搅
拌边加10%氯化钙溶液约5ml，用无菌滤纸将生成的沉淀过滤后，用20ml的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤渣，收集滤液加入100ml上述无菌中和剂，混合均匀％
2.2.2试验组：取供试液1ml，加入50ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，进行薄膜过滤，过滤前用少量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，转速170r/min过滤后用100ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分2次冲洗滤膜，在最后一次冲洗液中加入1ml含上述稀释成菌量50~100cfu 的菌液，过滤完后，取出滤膜，含金黄葡萄球菌、铜绿假单 胞菌、枯草芽胞菌的滤膜菌面朝上贴在胰酪大豆琼脂培养基,30~35@培养3~5d，含白念珠菌、黑曲霉的滤膜菌面朝上20~25@培养5~7d，点计菌数％
2.2.3菌液组：取1ml配好的菌液，加入50ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，薄膜过滤，取出膜贴在相应的培养基上培养％
2.2.4供试品对照组：同供试液组，不加菌液，同法培养％
2.2.5稀释剂对照组：取稀释剂代替供试液，按试验组的方法和条件冲洗，在最后一次冲洗液中加入1ml菌液％实验结
果见下表:5种菌的回收率实验结果见表2。
2.3控制菌方法学验证
2.3.1供试液制备：取1：10的供试液10ml，加入50ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，薄膜过滤，用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml分2次冲洗滤膜，转速170 r/min.
2.3.2金黄葡萄球菌：试验组：同2.3.1方法，在最后一次冲洗液中加入上述经计数的约70cfu/ml的金黄葡萄球菌，取出滤膜接种至胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30~35 ：培养18~24h，取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上。30~35：培养18~72h，观察。同法不加供试液做阳性对照，取50ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作阴性对照。下述2.3.3、2.3.4同法制备阳性对照和阴性对照。2.3.3铜绿假单胞菌：试验组：同2.3.1方法，在最后一次冲洗液中加入上述经计数的60cfu/ml的铜绿假单胞菌，取出滤膜接种到胰酪大豆胨液体培养基中，混匀,30~35：培养18~ 24h，取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上。30~35：培养18~72h，观察。
2.3.4白念珠菌：试验组：同2.3.1方法，在最后一次冲洗液中加入上述经计数的80cfu/ml的白念珠菌，取出滤膜接种到沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀,30~35：培养3~5d；取培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。30~35 ：培养18~24h，观察
3结果
3.1中和剂系统适用性验证结果：见表1%
防爆软启动柜
3.2供试品细菌、霉菌计数方法结果：见表2%
3.3控制菌方法验证结果：见表3%
表1中和剂各验证菌的回收率
组别
金黄葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌123123123
试验组706474697060797069菌液组757579818273878575供试品对照组000000000试验组回收率(％)94.985.393.785.285.682.285.382.392
组别
白念珠菌黑曲霉
123123
试验组757069736470菌液组848480817774供试品对照组000000试验组回收率(％)89.383.386.290.183.194.5收获时间到
表2微生物限度检查(薄膜过滤法)各验证菌的回收率
组别
金黄葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌123123123
试验组746459615952627069
菌液组797572767070738580稀释剂756770696258667577
供试品对照组000000000试验组回收率(%)
93.785.381.980.384.374.384.982.386.3
稀释剂对照组回收率(%)94.989.397.290.888.882.990.488.296.2
组别
白念珠菌黑曲霉
123123
试验组816954536470
菌液组898276817786稀释剂856972656574
供试品对照组000000试验组回收率(%)
91.084.171.165.483.181.4稀释剂对照组回收率(%)
95.584.194.780.284.486.0由上可知，各组回收率均大于70%，控制菌实验组阳性证实消除抑菌性方法可靠有效.
表3控制菌验证结果
组别金黄葡萄球菌铜绿假单胞菌白念珠菌试验组阳性阳性阳性
阳性对照组阳性阳性阳性
阴性对照组阴性阴性阴性
划线平板甘露醇氯化钠
琼脂
漠化十六烷基三
甲胺琼脂平板
沙氏葡萄糖
琼脂平板
4讨论
压电陶瓷驱动器医用超声耦合剂中含有的卡波姆是一种高分子材料，是一类非常重要的流变调节剂，形成凝胶状，有增稠、悬浮等重要用途，具有良好的涂展性，还可以消炎杀菌％本实验中，利用氯化钙溶液屏蔽了卡伯姆的羧酸基，使相互排斥作用减弱，而二价离子有可能和羧酸根结合形成盐类物质从而影响了卡伯姆凝胶的粘度，使其容易通过滤膜，加上卵磷脂和吐温80的中和灭活作用，消除了抑菌物质的抑菌性，寻出以卡伯姆作为基质，盐酸聚六亚甲基胍作为防腐剂的医用超声耦合剂的微生物检验方法。
参考文献
［1］孟勇涛，饶丽平•卡波姆在凝胶制剂中的使用问题的探讨［J］・齐鲁药事,2010,29(12)：708-709.
［2］熊佳佳，王柏•卡伯姆凝胶流变学特性及其影响因素研究［J］.
海峡药学,2006,18(4)：34-37.
［3］国家药典委员会•《中国药典》2015年版第四部通则［M］.北京：中国医药科技出版社,1105-1106.
［4］曲萍，仇丽霞，赵思俊，等•卡波姆抑菌凝胶剂微生物限度检查方法的建立［J］.药物分析,2013,33(8)：1317-1312.
［5］檀巧婷，严佳，周欣，等•快手洁手消毒凝胶的微生物限度检查方法学验证［J］・药学实践杂志,2014,32(5)：366-367,382.
(收稿日期：2020-08-04)
白明华
输血是临床多种疾病的常用方式，具有补充血容量、调节血液循环、增加携氧能力、改善凝血功能等多种作用，利于抗休克和防止出血性休克等疾病［1'2］o但血液制品内成分较为复杂，输血前筛查不规则抗体是保障输血安全性的重要措施。目前，血型抗体可分为规则抗体和不规则抗体，其中AB
O型血型内的抗体称为规则抗体，因检测技术的发展，该类抗体引起的溶血反应已大幅减少［3,4］%而不规则抗体主要指ABO型以外的抗体，在怀孕、器官移植或输血等因素影响下，体内血型意外抗体明显增多，给输血带来严重安全隐患，轻则输血失败，重则发生溶血反应威胁患者生命［5］o因此，临床更应重视输血前的精确检测，以筛查不规则抗体，准确了解患者不规则抗体类型，从而减少输血不良反应，保证输血安全。鉴于此，本研究旨在分析输血前不规则抗体筛查结果及其临床意义。报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料：选取本地区2018年1月至2020年5月需备血并进行不规则抗体筛查的患者5168例，其中男3004例，女2164例；年龄7~66岁，平均年龄(48±5)岁；单次输血量200~3000m l，平均单次输血量(986±54)m l；2393例有输血 或妊娠史、2775例无输血或妊娠史；1590例外科、3578例其他科室。
淀粉加工1.2方法：所有入院研究对象均于输血前Id抽取3m l肘静脉血，置入含有EDTA抗凝剂的采血管内，以3000r/min
DOI：10.11655/zgywylc2021.07.075
作者单位：030800山西省晋中市太谷区人民医院检验科速度离心10min，保存待测。以微柱凝胶技术
筛查不规则抗体，首先将样品和试剂平衡至室温，微柱凝胶抗人球蛋白卡上分别标记1、2、3，将50!的］、#、$号0.8%的不规则抗体筛查红细胞对应加入，在将患者25!1的血浆加入每个孔内，之后将卡片置于378恒温孵育器内15min'以DG Spin 细胞洗涤离心机进行离心，离心9min，离心半径为7cm。离心后于白背景处观察样品，统计不规则抗体检出率。鉴定方法：不规则抗体鉴定主要为菠萝酶法、盐水法和抗人球蛋白法，鉴定后均以标准谱细胞对照，以确定抗体特异性，不同类型抗体检测均按对应方法进行。判定标准：红细胞处于聚集和悬浮状态，并于凝胶柱上端和中部分布，则为阳性；游离红细胞多，分布于凝胶柱底部则为阴性。
1.3观察指标:①不规则抗体检出情况：记录5168例患者中不规则抗体检出状况和血型分布、抗体类型、不规则抗体阳性等情况。②不规则抗体检出影响因素：记录不同科室、不同性别和不同输血史/妊娠史患者不规则抗体检出情况。
1.4统计学方法：采用SPSS2
2.0软件分析数据，计数资料以％表示，用X2检验；计量资料以！±s表示，用t检验;#<0.05为差异有统计学意义。
2结果
紫铜电极
电伴热管缆
2.1不规则抗体检出情况：5168例患者中，检出135例不规则抗体阳性，阳性率为2.61%(135/5168)；其中Rh型占比最高，占39.26%(53/135)，其次为MNS型，占25.19%(34/135)；其他分别为Lewis型，占9.63%(13/135),Kidd型，占7.4% (10/135),P型，占5.93%(8/135)，其他类型占12.59%(17/135)。
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