一、 DEAE柱：
1. 准备柱子：
（1） 洗柱：洗涤剂、自来水、去离子水，洗至不挂水珠、水不成股下流。
（2） 浸泡滤膜：95%酒精，浸泡柱上下滤膜（包括胶圈）至少30min，时间可延长（5h左右），主要作用是脱去脂溶性杂质。每次柱使用完毕后都要做此步骤。 （3） 洗布氏漏斗：用10%HCL 抽滤，后用蒸馏水洗涤，去除滤膜板中可能灰尘。 （4） 装柱：铁夹夹紧对齐，装完柱后要检查是否漏水。
（1） DM过酸过碱：0.2M/L HCL 和NaOH 浸泡填料，先碱后酸，从加入碱时开始计时，一般为30min，加入时用玻棒搅动，以防与碱作用不充分。但若是新填料，浸泡20min后即可使用。碱对填料有影响，忌浸泡时间超过30min，一般20min即可。入碱后，用去离子水（﹥2L，充分去除OH根离子）在布氏漏斗上过滤。脱水完全(洗2-3遍至中性)。后浸泡酸。重生
方法同上。
（2） 脱气：先溶解DM，再倒入抽滤瓶，真空抽滤，至无白沫，可时而摇晃，抽至无白沫无气泡。重要，最好能延长脱气时间。
3. 上柱：
倾倒填料时浓度尽量稀，使填料贴壁下流。静止。待填料沉降，吸出上清液，统一收集，反复此操作，尽可能回收填料。（尽量不起气泡）沉降一段时间后，待上清未完全沉降时倒入尚未倒完的胶，防止多次倾倒引起的分层现象。此时，用夹子夹住软管，使其不漏液，待沉降完全，出现清水层，去除夹子，滴液。
4. 平衡：
若上柱平衡后暂时不上样，可隔一天平衡一次，防止长菌。滴数：三秒1滴，20分钟收集一管约10ml，33小时过柱一体积。水层不能滴干，防止胶出现干裂现象。
5. 检验：
用1M AgNO3 检验过柱水中Cl离子是否洗净，至无Cl离子后再过一柱体积。皆用去离子水。
6. 上样：
（1） 粗柱子：DEAE量占柱体积80%高度（标记高度，要有足够的塔板数），上8克样。上样步骤：先将螺旋拧开，用夹子夹紧软管，放在液面以上，使其液面不下降。取出上层流动相，使液面与填料面相切，用移液管加样，加样使尽量靠近填料，贴着柱子壁转一圈，均匀加样。加完后用流动相洗一下残留在壁上的样品。松开夹子，使其滴液，待样品吸附上填料后，夹紧夹子，放在液面以上，在柱子内加入一段流动相，拧上螺旋，开始走样。
（2） 流速：六秒一滴。
（3） 流动相：视多糖的实际情况而定。
7. 硫酸苯酚法测多糖：
先确定样品出现的管数，确定头和尾后，三管一测。
（1） 方法：100微升样品，400微升5%苯酚(头)，2ml浓硫酸(移液管美容喷雾器)。振荡后静置1小时。490nm处测量。
（2） 试剂的配置：苯酚沸水浴溶解，制备5%溶液500ml备用。
8. 收集：
9. 旋蒸：
收集到一定量后，进行旋蒸，浓缩至10ml内。
（1） 透析袋的准备：剪20cm左右透析袋，烧杯中沸煮5分钟后用蒸馏水60℃冲洗2分钟，4℃待用。使用后用蒸馏水或者加0.05%-0.1%的叠氮钠的蒸馏水保存，每次使用之前都用水清洗、沸煮。（非即用型）
（2） 透析袋的选择：一般根据所得的糖的分子大小来选择透析袋，在未知的情况下使用孔径最小的透析袋（截留分子量3000）。
（3） 透析：加样至透析袋的2/3，两头用夹子夹住，纯水透析，一小时换一次水，4至5次。过夜。
11、再次浓缩至高度少于1cm，冻干。
二、G100柱：
1、G100的准备：
（1） 先确定装柱的体积，再确定装柱的质量，具体换算公式为：1克凝胶吸水10ml*10倍即100（G100型号判定）。
（2） 将胶泡在将胶泡在超纯水，3天，多放点水，要换水去杂质。（新胶）
（3） 脱气。
2、装柱：
（1） 将胶混匀装柱，不可起泡，倒入装柱，玻棒引流。最好是边轻轻搅动边倒胶。
（2） 沉降，接恒流泵，平衡流速极慢。平衡至胶的高度不变。
3、流速：上样后流速50分钟6ml。
4、流动相：万分之一的NaN3，其他视实验要求而定。
5、当柱子压力变大，流速自动变慢后，可倒流冲洗，流速可快一点。
6、上样：
110mg左右，溶至1ml，震荡漩涡器充分溶解，上样之前过滤。上样时，取出胶面上层的清夜，将样品贴在柱子内侧成圈状加样，越靠近胶面越好，残留在柱子上的样品越少越好。少量流动相清洗柱子壁。待样品都吸附在胶上，加上上清流动相，开始走样。
7、检测方法：
50ul样+1ml 5%苯酚（配制苯酚时，所有容器预热）+2ml浓硫酸，室温后测量。490nm。收集到一定量后，浓缩至10ml以内。
8、透析：
加样至透析袋的2/3，纯水透析，一小时换一次水，4至5次。过夜。用最小截留分子量的透析袋。
透析袋分即用型和非即用型，即用型用蒸馏水冲洗后直接使用，无需前处理。非即用根据说明书进行前处理，比较常见的处理方法为：用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净。
使用时，一端用透析夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50％是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯。小量体积溶液的透析，可在袋内放玻璃棒，以使透析袋沉入液面以下。使用时需戴手套。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃医院用筋膜仪蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3，以防长菌。一旦已呈湿状即不可再完全干躁。
9、再浓缩：
浓缩后的量越少越好，液体的厚度不要超过1cm。
10、冻干。
三、蛋白检测：
考马斯亮蓝法测蛋白：
抛光毛刷1、考马斯亮蓝染液的配制：
准确称取100mgCBB，溶于50ml 95%乙醇溶液中，与100ml 85%磷酸（W/V）混合，加水至1000ml。充分溶解去固体。
2、标准蛋白溶液的配制：
已知浓度的蛋白溶液（BSA），用生理盐水配制成100ug/ml 蛋白溶液。制成母液。
3、标准曲线的测定：
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，室温放置5min，以0号管为空白对照，在595nm处比。制作标准曲线。
4、样品的测定：
四、分子量测定：
HPLC谱仪由Beckman Coulter System Gold 508自动进样器，Gold 126 gradient HPLC 泵及 Sedex 75ELSD检测器构成；谱柱为TSK-GEL G4000PW（XL）。流动相为0.003mol/LNH4AC，流速0.5mL/min，样品溶于流动相中，浓度为0.2%（w/v），进样量10μL。用不同已知分子量的Dextran-T系列葡聚糖制作标准曲线，根据分子量与保留时间RT的关系，即可算出多糖的分子量。
五、GC-MS前处理：
1、判断多糖极性：
取样品2mg，溶于4 mL2 mol/L TFA中，110℃下封管水解1.8h，加甲醇反复减蒸发缩至干，以完全去除TFA。水解产物溶于0.2mL水中，取5μL进行TLC分析。展开剂系统为乙酸乙酯：吡啶：冰乙酸：水=5：5：1：3vcd制作（v/v），展开距离为8cm。待溶剂挥干后，用苯胺-邻苯二甲酸试剂（将1.6g邻苯二甲酸溶于100 mL水饱和正丁醇中，加入0.9 mL苯胺。）显。用该试剂喷雾后，于105℃加热5-10min，己糖、脱氧己糖呈黄褐，戊糖和糖醛酸呈粉红。因此若样品含糖醛酸，即会出现迁移率较小（Rf约为0.1）的粉红斑点，反之则可确定为不含糖醛酸。
2、中性多糖：
TFA水解产物溶于2 mLH2O中，加入25mgNaBH4，室温下还原2h，间歇振荡，用乙酸中和至无气泡产生，反复加甲醇减压蒸发至完全干燥。于100℃下干燥15min，加入2 mL乙酸酐（可多加些），100℃反应1h。反复加甲苯减压蒸发除去乙酸酐（蒸干彻底），产物经氯仿萃取，水洗四次，氯仿层经无水硫酸钠干燥，浓缩至50μL后进行逗号刮刀GC-MS分析。
3、Conrad法：
将15mg多糖样品溶于10mL水中，加入N-环己基-N’-（2-N-甲基吗啉代乙基）-碳二亚胺-对甲苯磺酸盐300mg，磁力搅拌下滴加0.01mol/L的HCl，用自动电位滴定仪使pH保持为4.75，维持离心浓缩2h。滴加2mol/L硼氢化钠溶液（20mL），此时pH值急剧上升，须用4mol/L的HCl将pH控制在7.0，持续搅拌，控制硼氢化钠溶液在45min内加完，若反应中生成大量泡沫，可滴加几滴异戊醇消泡。加完后，在室温下继续反应1h，滴加冰醋酸使pH为6.8。然后将反应液对蒸馏水透析，内液减压浓缩至10mL，冷冻干燥。此反应通常须进行2-3次，取少量样品经2 mol/L TFA完全水解后进行TLC分析以确定是否完全还原。
4、酸性多糖：
1）取一部分TFA水解产物按与中性多糖相同的方法进行处理，测定其中中性糖基的组成；2）另取一部分多糖先用Conrad法[16]还原，再经TLC法检测还原是否完全。完全还原后的产物用中性多糖相同的方法进行处理，然后进行GC-MS分析。比较同一样品还原前后的GC结果，若其中某一中性糖含量明显增加，即可确定所含糖醛酸的种类及含量。步骤1）中水解时部分释放的糖醛酸可能形成内酯，经硼氢化钠还原为糖醇，从而导致GC测定时某
些中性糖含量增加，因而由此计算出的糖醛酸含量通常偏低。
5、注意事项：
去水蒸干时，试剂可以多加一些，蒸干时要彻底。
六、甲基化：
取9mg样品于反应瓶中，置于盛有五氧化二磷的干燥器中真空干燥过夜。样品溶于2mL无水二甲亚砜（经4A分子筛干燥）中，加入粉末状氢氧化钠20mg左右，室温下搅拌10min，后滴加2mL（可多加一些3ml），室温下搅拌30min，<30℃减压蒸发除去未反应的，反应液对蒸馏水透析，内液减压浓缩（蒸不出去可加点水共沸）后冻干。此过程重复4次后，取少量甲基化产物以五氧化二磷为干燥剂真空干燥24h，然后用石蜡膜法（Nujol）测定IR谱，以确定甲基化是否完全。完全甲基化的多糖，其IR谱中3400cm-1处的OH峰会消失。
完全甲基化的多糖用90%的甲酸（2mL）于100℃加热解聚4h，减压蒸干，然后加入2mol/L TFA（3mL），于100℃下加热水解6h，加甲醇反复减压浓缩至干，以完全出去TF
A。水解产物溶于2 mLH2O中，加入25mgNaBH4，室温下还原3h，间歇振荡，后用乙酸调pH至5左右，加入2mL甲醇及一滴乙酸，减压蒸干，重复三次使硼氢化钠完全分解，并转化为乙酸钠。100℃下干燥10min，加入2mL乙酸酐于100℃反应1h，加入甲苯反复减压蒸发至完全干燥。所得乙酰化产物用氯仿萃取，蒸馏水洗涤4次，氯仿层用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩至0.1mL左右，进行GC-MS分析，根据相对保留时间及MS离子碎片峰鉴定各组分甲基取代的位置。
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