连花清瘟胶囊中6种有效成分的毛细管胶束电动谱法测定 霍鹏;覃莎;黄丽涵;徐远金
【摘 要】建立了毛细管胶束电动谱法同时测定中药复方制剂连花清瘟胶囊中甘草苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、绿原酸、大黄酸6种药效成分含量的分析方法.使用未涂层弹性石英毛细管,以50 mmol/L SDS-15mmol/L磷酸氢二钠-15 mmol/L硼酸(含25%异丙醇,pH=8.0)作电解质,于254 nm下紫外检测,被测组分在30 min内获得基线分离.甘草苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、绿原酸、大黄酸的质量浓度分别在4.5～120、3.0～100、1.5～50、1.5～100、4.5～600、0.90～160 mg/L范围内与峰面积呈良好线性关系,检出限分别为1.5、1.0、0.50、0.50、1.5、0.30 mg/L.样品加标回收率为90%～108%,相对标准偏差均不大于4.2%.方法简便、快速,已成功用于实际样品的分析.%A micellar electrokinetic capillary chromatographic (MEKC) method was established for the simultaneous determination of liquiritin, rutin, hyperin, quercitrin, chlorogenic acid and rhein in Lianhuaqingwen Capsule. Effects of experimental conditions, such as pH value, concentration of sodium dodecyl sulfate( SDS), type of organic modifier, concentration of background electrolyte and applied voltage, on se paration efficiency of six targeted compounds were optimized. A baseline separation of six components was achieved in 30 min when the samples were separated on an uncoated fused silica capillary column(75 μm ×60 cm, effective length 50 cm), using 50 mmol/L SDS - 15 mmol/L Na2HPO4 -15 mmol/L H3BO3 (containing 25％ 2-propanol, pH ＝ 8. 0)as running buffer,with applied voltage of 30 kV. The analytes were detected by UV detection at 254 nm. Under the optimum conditions, the calibration curves were linear in the range of 4. 5 - 120 mg/L for liquiritin,3.0 - 100 mg/L for rutin, 1.5 - 50 mg/L for hyperin, 1.5 - 100 mg/L for quercitrin, 4. 5 - 600 mg/L for chlorogenic acid and 0. 90 - 160 mg/L for rhein with detection limits of 1.5, 1. 0, 0. 50,0.50, 1.5, 0. 30 mg/L, respectively. The average recoveries of the six components were between 90％ and 108％ with all relative standard deviations not more than 4. 2％. The developed method was simple, rapid and accurate, and was suitable for the routine analysis of the six effective components in Lianhuaqingwen Capsule.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2011(030)004
【总页数】5页(P396-400)
【关键词】WWW.02245.INFO毛细管胶束电动谱;连花清瘟胶囊;有效成分;同时测定
【作 者】霍鹏;覃莎;黄丽涵;徐远金
【作者单位】广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西南宁,530004;广西大学化学化工学院,广西南宁,530004;广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西南宁,530004;广西大学化学化工学院,广西南宁,530004;广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西南宁,530004;广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西南宁,530004;广西大学化学化工学院,广西南宁,530004 【正文语种】中 文
智能游戏者
【中图分类】O657.7;R283
连花清瘟胶囊是由金银花、连翘、鱼腥草、大黄、甘草、炒苦杏仁、炙麻黄、石膏、板蓝根、薄荷脑、绵马贯众、广藿香、红景天等多味中药制成的中药制剂，具有清瘟解毒、宣
肺泄热的功效，临床上用于流行性感冒属热毒袭肺症，可明显改善流感患者发热或高热、恶寒、肌肉酸痛、鼻塞流涕、咳嗽、头痛、咽干咽痛、舌偏红、苔黄或黄腻等临床症状或体症。其中金银花中的绿原酸，连翘中的芦丁，鱼腥草中的金丝桃苷和槲皮苷，甘草中的甘草苷以及大黄中的大黄酸为连花清瘟胶囊中的有效成分。已有采用毛细管电泳法［1－2］和HPLC法［3－4］测定金银花中绿原酸的含量，采用HPLC法测定鱼腥草中的金丝桃苷和槲皮苷［5］及甘草中甘草苷的含量［6－7］;采用毛细管电泳法测定连翘中的黄酮类成分芦丁［8－9］及用胶束电动毛细管谱法测定大黄中主成分含量的文献报道［10－14］。但采用毛细管胶束电动谱法测定连花清瘟胶囊中的药效成分含量和同时测定甘草苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、绿原酸、大黄酸的分析方法均未见报道。
毛细管胶束电动谱法(MEKC)是以胶束为假固定相的一种电动谱，是电泳技术和谱技术的巧妙结合，能同时分离带电化合物和电中性化合物，是分析小分子物质的有力工具［15－16］。本文建立了MEKC法同时测定连花清瘟胶囊中甘草苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、绿原酸、大黄酸6种药效成分含量的分析方法。方法准确度高，操作简便，可用于该制剂的质量控制。
P/ACETMMDQ毛细管电泳仪带二极管阵列检测器(美国Beckman公司);未涂层弹性石英毛细管(75 μm×60 cm，有效长度50 cm)(河北永年锐沣谱器件有限公司);Orion 720A型酸度计/离子计(美国Thermo公司);Synthesis A10TM超纯水系统(美国Millipore公司);ME 215S电子天平(德国Sartorius公司)。
十二烷基硫酸钠(SDS，分析纯，Sigma公司);甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈(谱纯，Fisher公司);其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水;甘草苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、绿原酸、大黄酸对照品(中国药品生物制品检定所);样品连花清瘟胶囊为石家庄以岭药业股份有限公司产品，国药准字:Z20040063(产品批号:091208、0911142)。
对照品储备液:准确称取甘草苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、绿原酸、大黄酸对照品各0.010 0 g，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1.00 g/L的对照品储备液，密封于4℃下冰箱中保存，实验时用80%甲醇稀释至所需浓度。
样品预处理:取数粒胶囊样品的内容物，混匀，精密称取2.5 g，置具塞锥形瓶中，加入20 mL甲醇超声提取60 min后，取出，放冷，－4℃下以4 000 r/min离心15 min，吸出上清液至25 mL容量瓶中，残渣用甲醇洗涤后重新提取1次，合并上层清液，用甲醇定容至25 mL，思情乐园
摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。
电泳条件:以50 mmol/L SDS－15 mmol/L磷酸氢二钠－15 mmol/L硼酸(含25%异丙醇，pH=8.0)作电解质，未涂层弹性石英毛细管(75 μm×60 cm)为分离通道，压力进样(3 448 Pa×8 s)，分离电压为30 kV，分离温度为25℃，检测波长为254 nm。缓冲溶液与样品均用0.45 μm滤膜过滤，并用超声波脱气5 min。毛细管使用前用0.1 mol/L氢氧化钠活化30 min，然后用水和缓冲溶液各冲洗10 min，每两次运行之间用缓冲溶液冲洗3 min，更换缓冲溶液时先用超纯水和新的缓冲溶液各冲洗5 min。同一缓冲溶液运行3～4次后更换。
2.1.1 SDS浓度对分离的影响 考察了缓冲液中分别加入40、45、50、55、60 mmol/L SDS时的分离效果。实验结果表明，SDS浓度太低时，金丝桃苷和槲皮苷不能得到很好分离;随着SDS浓度增加，各组分的分离度增大，但迁移时间也随之延长。综合考虑分离度和分析时间，本实验选择SDS浓度为50 mmol/L。
2.1.2 缓冲溶液pH值对分离的影响 缓冲溶液的pH值不仅影响石英毛细管内壁硅羟基的电离，从而影响电渗流，还影响被测物的有效电荷数，因此通过调节缓冲液的pH值可改变分析物的迁移行为和分离效率。实验发现当pH小于6.0时，芦丁和金丝桃苷不能实现完全分猪肉精
离，且总的运行时间较长;pH超过10.0后，各物质的峰形开始变差，且化合物的迁移时间随pH值的升高而延长。考察了pH为6.0～10.0时对各峰的影响，结果如图1。当pH=8.0时，各组分已达到基线分离，且各组分的迁移时间短，故本实验选用pH 8.0为最佳缓冲溶液pH值。虹膜采集器
2.1.3 缓冲溶液中磷酸盐浓度对分离的影响 实验发现，Na2HPO4浓度较小时，各组分的迁移时间短，但峰形较宽，当Na2HPO4浓度低于5 mmol/L时，金丝桃苷与槲皮苷未能达基线分离;考察了Na2HPO4浓度在5～25 mmol/L范围内对分离的影响，结果如图2所示。随着Na2HPO4浓度的增大，相邻组分的分离度增大，本实验选定Na2HPO4的最佳浓度为15 mmol/L。
2.1.4 缓冲溶液中硼酸浓度对分离的影响 考察了硼酸浓度在5～25 mmol/L范围内对分离的影响。结果表明，当硼酸浓度过低或过高时均会导致金丝桃苷与槲皮苷两峰之间的分离度降低，本实验选择硼酸的最佳浓度为15 mmol/L。
2.1.5 有机改性剂对分离的影响 有机溶剂的加入会改变背景电解质溶液的粘度、电泳淌度及熔硅毛细管壁的ξ电势。由于所测组分的疏水性质，常用的有机改性剂有甲醇、乙醇、乙
煎药锅腈、异丙醇和丙酮。实验考察了上述常用有机改性剂对各组分的分离效果，实验结果见图3。结果表明，加入甲醇、乙腈和丙酮不能使组分得到完全分离，特别是在实际样品分析中，金丝桃苷与连花清瘟胶囊中的其它组分无法得到基线分离;加入乙醇后基线波动明显增大。加入异丙醇后，各组分间的分离度好且灵敏度较高，因此本实验选择异丙醇作为有机改性剂。实验还考察了异丙醇的体积分数在10%～40%范围时对分离的影响，结果表明缓冲溶液中的异丙醇为25%时，各组分间的分离度最大，因此选择加入异丙醇的体积分数为25%。
2.1.6 分离电压及进样时间对分离的影响 考察了分离电压对被测物迁移时间、峰形和分离度的影响。结果表明，随着分离电压的升高，电渗流速度加快，样品的分析时间明显缩短，峰形尖锐。当分离电压达30 kV时，各组分得到快速而有效的分离，5次重复测定的相对标准偏差(RSD)小于2%。
固定3 448 Pa的压力进样，在6～12 s范围内改变进样时间。实验表明进样时间越长，测定的灵敏度越高。但随着进样量的增大，溶质区带加宽，分离度下降，峰形变差。综合考虑灵敏度和分离度因素，选择进样时间为8 s。
由对照品储备液精确配制成不同质量浓度的系列混合溶液，在优化条件下进行分析，分别重复进样3次，以峰面积平均值(Y)对被测组分的质量浓度(X，mg/L)进行回归分析。以信噪比S/N=3计算6种组分的检出限。方法的回归方程、线性范围和检出限结果见表1。
取同一批次相同浓度的样品5份，按“1.2”方法制备样品溶液，在优化实验条件下测定，各组分峰面积的相对标准偏差为0.37%～1.9%(见表1)，表明该方法的精密度高。
取同一样品溶液，在优化实验条件下分别于0、2、4、6、8 h测定5次，记录峰面积变化，6种组分含量的RSD为0.45%～3.9%。表明样品溶液在8 h内稳定。
精密称取已知甘草苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、绿原酸和大黄酸含量的同批样品共9份，每3份为一组，按低、中、高3个浓度分别加入对照品溶液，按“1.2”方法制备样品溶液进行测定，6种组分的平均回收率范围为90%～108%，相对标准偏差为0.98%～4.2%(见表2)。
分别精密吸取不同批号样品，按“1.2”方法制备样品溶液进行分析，结果见表3。对照品及样品的电泳谱图见图4，6种有效组分在30 min内可获得基线分离。
【相关文献】
［1］ 吕元琦，邬春华，袁倬斌．毛细管电泳法测定复方鱼腥草片中的绿原酸和槲皮素［J］．分析测试学报，2004，23(6):106－108．
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