中国科学B辑：化学 2009年 第39卷 第10期: 1251~1261 www.scichina chem.scichina 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS
双子表面活性剂及其保护的纳米金作为缓冲添加剂用于毛细管电泳蛋白质分离刘倩, 李燕清, 杨艳敏, 姚守拙* 湖南大学化学化工学院, 化学生物传感与计量学国家重点实验室, 长沙 410082
* 通讯作者, E-mail: mailto:szyao@hnu
收稿日期: 2009-05-18; 接受日期: 2009-06-01
摘要报道了使用阳离子双子表面活性剂作为毛细管电泳的缓冲添加剂用于同时分离酸性和碱性蛋白质. 在酸性的缓冲条件下, 只需要使用低浓度的阳离子双子表面活性剂(0.1 mmol/L 18-s-18)作为缓冲液的添加剂, 就可以有效地抑制酸性和碱性蛋白质在毛细管壁的吸附, 从而得到高效的蛋白质分离. 实验表明, 较小的胶束尺寸(如s=5~8)比大的胶束尺寸(如s<4或>10)能更有效地抑制酸性蛋白质的吸附. 改变双子表面活性剂的中间基的长度能够对蛋白质的电泳淌度进行一定的调节, 从而对分离的选择性进行一定的优化. 在最优的实验条件下, 蛋白质迁移时间的日内和日间标准偏差(RSD)分别小于0.8%和 2.2%, 回收率为79%到100.4%. 另外，还考察了双子表面活性剂保护的金纳米颗粒用作毛细管电泳缓冲添加剂在蛋白质分离
中的应用. 实验表明, 在缓冲液中加入纳米金能够缩短分析时间, 并能小幅度地提高分离效率. 最后，使用该方法分析了一系列复杂生物样品, 包括血浆、红细胞和鸡蛋清样品, 均得到了满意的结果. 关键词
双子表面活性剂蛋白质分离
毛细管电泳
自动面膜机金纳米粒子
1引言
毛细管电泳(CE)具有高分辨率、高分离效率、自动化程度高等显著优点, 因此在人类基因组学的研究中发挥了重大作用. 在如今所谓的“后基因组时代”, CE也被认为是一种非常有潜力的蛋白质组学研究的工具. 但是到目前为止, CE在蛋白质组学还没有得到广泛应用, 其中一点非常重要的原因就是蛋白质非常容易在毛细管壁吸附, 导致分离效果很差[1]. 为了解决这个问题, 研究者们提出了很多方法. 早期的方法有使用极端的pH[2]或使用高浓度的缓冲盐[3], 但是这样容易导致蛋白质变性. 最近Le等人[4]也提出了一种基于核酸配体的方法来有效地抑制蛋白质的管壁吸附.
最常用的抑制蛋白质管壁吸附的方法是使用毛细管涂层. 聚合物是一种比较好的涂层材料. 中性聚合物如聚氧乙烯(PEO)[5]、聚乙烯醇(PV A)[6]、聚丙烯酰胺(PAA)[7]和纤维素[8]等, 都已经成功地用于制备
毛细管涂层并用于高效蛋白质分离. 但是, 聚合物涂层毛细管的寿命还不是很理想. 虽然交联能够大大提高涂层的稳定性, 但是操作又相对比较复杂[7]. 阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)[9], PDDA[10], 聚凝胺(polybrene)[11], 壳聚糖[12]等也有报道用于蛋白质分离. 其中PDDA有报道在高浓度时可用于同时分离阳离子和阴离子蛋白质[13].
使用表面活性剂也是一种非常有前途的毛细管电泳蛋白质分离的方法. 早期使用的表面活性剂有
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刘倩等: 双子表面活性剂及其保护的纳米金作为缓冲添加剂用于毛细管电泳蛋白质分离
单链的阳离子表面活性剂, 如十六烷基三甲基溴/氯化胺(CTAB/C)[14,15]. 我们最近也报道了使用CTAB作为缓冲添加剂来进行复杂生物样品和蛋白组样品的分析[16]. 但是CTAB必须在缓冲中保持一个较高的浓度(≥2 mmol/L)才能有效地抑制酸碱蛋白的吸附. Lucy等人[17]报道了使用双链表面活性剂如双十二烷基二甲基溴化胺(DDAB)作为半永久毛细管涂层用于分离碱性蛋白质. 这种双链表面活性剂能够形成比单链表面活性剂更稳定的涂层, 因此在电泳分离时, 不需要往缓冲液中添加表面活性剂. 其他的一些表面活性剂, 如阴离子[15]、非离子[18]、两性[19]和混合表面活性剂[20]也都有报道用于蛋白质分离. 特别是两性的磷脂涂层可用于同时分离酸性和碱性蛋白质, 因此得到了较多关注[21]. 但是磷脂涂层的一个缺点就是制备比较麻烦[22]. 总的来说, 新型的表面活性剂涂层仍然还有待开发, 而能否用于同时分
离酸性和碱性蛋白质已成为衡量涂层优劣的一个标准.
双子表面活性剂(gemini)是一类新型的表面活性剂[23]. 它由两条疏水尾链、两个极性头基和一个连接极性头基的中间基构成. 与同类的单链表面活性剂相比, 双子表面活性剂具有很多的优点, 如更好的水溶性, 更低的临界胶束浓度(CMC), 更好的表面活性等[23,24]. 特别是, 中间基能够显著影响双子表面活性剂的性质[25]. 这些特点也使gemini成为一种非常有趣的毛细管涂层材料. 在我们以前的报道中, 我们使用了一类阳离子双子表面活性剂 alkanediyl-α, ω- bis(dimethylalkylammonium bromide) (m-s-m)作为毛细管的动态和半永久涂层来分离碱性蛋白质[26,27]. 这些gemini涂层能使电渗流(EOF)反向, 并能有效地抑制碱性蛋白质的管壁吸附, 得到高达500000以上的塔板数[27]. 但是, 在我们以前的工作中, 仅仅是碱性蛋白质得到了分离, 因此gemini在CE蛋白质分离方面的应用还有待于进一步深入研究.
在本文中, 我们报道了一种非常简单的同时分离酸性和碱性蛋白质的CE方法. 我们使用低浓度(0.1 mmol/L)的阳离子双子表面活性剂18-s-18作为毛细管电泳缓冲液的添加剂, 同时分离了p I为4.7到11.0的八种蛋白质. 此外, 我们还报道过双子表面活性剂保护的金纳米粒子(gemini@AuNPs)的合成[28]. 纳米粒子具有很高的比表面积, 可以和毛细管壁以及分析物发生作用, 因此在CE中常被用作缓冲添加剂或伪固定相. 尤其是金纳米粒子, 已有报道可用于增强CE分离效率和选择性[29], 以及促进DNA[30]和蛋白质的CE分离[31]. 考虑到gemini@AuNPs 能够结合纳米粒子和双子表面活性剂的优点, 因此, 在本工作中, 我们也尝试了将其用作CE蛋白质分离的缓冲添加剂. 最后, 我们在文中报道了该方法在生物样品分
析中的应用, 包括血浆、血红细胞(RBCs)和鸡蛋清样品的分析.
2实验部分
2.1试剂
双子表面活性剂 18-s-18 ([C18H37(CH3)2N(CH2)s- N(CH3)2C18H37]2Br, s=3, 4, 5, 6, 8, 10和12)参考以前文献报道的方法合成[28,32]. 合成后将其配成1 mmol/L 的储备溶液. DDAB, 胰酶抑制剂, α-胰凝乳蛋白酶原A, 核糖核酸酶A, 细胞素c, 碳酸酐酶, 溶菌酶, 牛血清白蛋白(BSA)和肌红蛋白购于Sigma试剂公司. 蛋白质用纯水配成0.1 mg/mL的样品备用. 磷酸缓冲液用浓磷酸稀释而成, 然后用NaOH水溶液调到需要的pH. 实验中使用的水均为Millipore超纯水. 所有的试剂均为分析纯.
2.2仪器
CE实验均在Beckman-Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳仪上进行. 紫外检测波长为214 nm. 数据采集速率为8 Hz. 使用的毛细管(河北永年锐沣)长度为50 cm (进样端到检测窗口的长度为40 cm), 内径50 μm, 外径375 μm. 所有的冲洗步骤均在138 kPa的高压下进行. 毛细管的温度恒定在(25±0.1)℃.
2.3 双子表面活性剂保护的金纳米粒子的合成
双子表面活性剂保护的金纳米粒子按照我们以前报道的方法合成[28]. 简言之, 200 μL的HAuCl4水溶液(14.7 mmol/L)在搅拌的条件下加入到10 mL的gemini水溶液(1 mmol/L)中, 然后加入33 μL新配的0.4 mol/L NaBH4水溶液, 继续搅拌2 min, 得到的胶体溶液在室温下静置3 h后使用. 纳米金使用Beckman Coulter DU 800紫外可见吸光光度计进行表征, 在521 nm左右有特征吸收峰. 按照此步骤制备得到的AuNPs标记为1×gemini@AuNPs.
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2.4透射电镜(TEM)
胶束的负染TEM图像在JEOL 3010透射电镜上拍摄得到. 工作电压为300 kV. 负染样品如下制备: 在碳膜铜网上滴一滴0.1 mmol/L 的表面活性剂溶液, 将多余的溶液用滤纸吸掉. 然后将铜网浸入饱和醋酸双氧铀水溶液中1 min负染胶束, 最后将铜网取出在空气中晾干.
2.5蛋白质分离
新毛细管分别用1 mol/L NaOH冲洗10 min, 水冲洗2 min, 缓冲液冲洗10 min. 在分离的时候, 如果缓冲液的组成发生了改变, 就使用新管冲洗程序处理毛细管, 否则的话就用缓冲液冲洗2 min. 样品从阴极端
进样, 进样压力3.4 kPa, 进样时间5 s, 分离电压为−20 kV. 缓冲为10 mmol/L磷酸盐缓冲(pH 3.0). 缓冲液每运行3次更换一次. 当使用表面活性剂作为缓冲添加剂时, 毛细管在分离前用含表面活性剂的缓冲液平衡10 min. 当使用表面活性剂作为半永久涂层时, 毛细管用含0.1 mmol/L表面活性剂的缓冲冲洗10 min使表面活性剂吸附到管壁, 然后多余的表面活性剂用缓冲冲出毛细管. 分离效率(N) 由32 Karat软件根据半峰宽进行计算. EOF是通过监测200 nm波长处的系统负峰来计算. 该峰由进样时样品与缓冲组成差异所产生, 是一个相对EOF静止的系统峰, 因此可作为EOF的标记峰[33]. 从阳极流向阴极的EOF为正的EOF, 反之为负的EOF. 迁移时间的日内重现性是基于连续6次进样来计算, 而日间重现性是基于连续3天的实验来计算. 蛋白质回收率使用Towns 等人报道的方法来进行计算[18].
2.6生物样品分析
蛋清样品通过直接将新鲜鸡蛋清用水稀释100倍而制得. 血浆和血红细胞样品如下制备: 首先将10 μL 健康成人的血液用含50 mmol/L KCl 的33 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 7.4)稀释到1.0 mL, 在2500 r离心10 min, 将上清液用水稀释100倍即为血浆样品. 将剩下的固体收集起来, 加入2.0 mL水使细胞裂解, 即得到血红细胞样品. 生物样品均保存在−20℃. 3结果与讨论
3.1 使用不同表面活性剂的蛋白质分离的比较
阳离子表面活性剂已经被证明为一种非常有效的毛细管涂层用于分离碱性蛋白质. 它们能够形成带正
电的涂层覆盖掉管壁的带负电的硅醇烷基团[34]. 图1比较了不同的表面活性剂作为涂层或者缓冲添加剂时的分离效果. CTAB的分离效果我们在另外一篇文章中已经详细报道[16]. CTAB能够用于分析复杂的蛋白样品, 但是它必须要使用在一个较高的浓度下(≥2 mmol/L)才能得到理想的分离效果, 而较低浓度的CTAB, 如0.5 mmol/L (如图1(a)所示), 则不能有效抑制酸性蛋白质的管壁吸附. 我们也尝试了使用
图1 不同条件下蛋白质分离的比较
毛皮加工
(a) 使用0.5 mmol/L CTAB作为缓冲添加剂; (b) 使用0.1 mmol/L DDAB作为缓冲添加剂; (c) 使用18-5-18作为毛细管半永久涂层. 涂层通过用0.1 mmol/L 18-5-18水溶液冲洗毛细管10 min来制备, 然后多余的表面活性剂用缓冲液冲掉; (d) 使用0.1 mmol/L 18-5-18作为缓冲添加剂. 缓冲, 10 mmol/L 磷酸盐 (pH 3.0). 实验条件: 石英毛细管, 长度50 cm (有效长度40 cm) × 50 μm 内径; 分离电压, −20 kV; 进样, 3.4 kPa 进样5 s; 检测波长, 214 nm. 峰号: (1) 胰酶抑制剂, (2) α-胰凝乳蛋白酶原A, (3) 核糖核酸酶A, (4) 细胞素c, (5) 碳酸酐酶, (6) 溶菌酶, (7) BSA, (8) 肌红蛋白
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DDAB作用缓冲添加剂来分离蛋白质. 如图1(b)所示, 当在缓冲液中添加0.1 mmol/L DDAB后, 五种碱性蛋白质能够得到了较好的分离, 但除胰酶抑制剂外的酸性蛋白质并没有出峰. 增高DDAB的浓度到0.5 mmol/L 或者优化pH也不能得到满意的分离效果. 如果将DDAB不作为缓冲添加剂而作为半永久涂层的话, 也就是说电泳缓冲中不含DDAB, 得到的分离效果更差, 仅仅只有四种碱性蛋白质能够得到分离. 另外, 我们以前报道过双子表面活性剂作为半永久涂层可有效地分离碱性蛋白质(如图1(c)所示)[27], 但是, 该半永久涂层仍然不能分离酸性蛋白质和肌红蛋白. 非常有意思的是, 但我们把双子表面活性剂作为缓
冲添加剂而不是涂层来使用的时候(如图1(d)所示), 所有的八种蛋白质, 包括酸性和碱性蛋白质均得到了较好的分离. 其中, BSA的分子稳定性比较差[35], 所以它的峰不是特别尖, 但是其他的几种蛋白质的峰形都比较好.
Lucy等人在近期发表的一篇综述文章详细讨论了蛋白质在毛细管壁吸附的机理[35]. 蛋白质吸附是一个相当复杂的过程, 其中包含了很多种作用力, 如静电作用、疏水作用和蛋白质的构型变化等[1]. 本文的分离在酸性的条件下进行, 因此蛋白质和管壁均荷正电. 当使用低浓度的CTAB或者DDAB作为缓冲添加剂时, 虽然酸性蛋白质也荷正电, 但是它们仍然可以吸附在荷正电的管壁上, 说明酸性蛋白质和毛细管壁之间还存在静电作用以外的作用力. 但是当0.1 mmol/L gemini作为缓冲添加剂时, 酸性蛋白也得到了较好的分离, 说明此时gemini和蛋白质形成的复合物与Gemini涂布的毛细管之间存在足够大的静电排斥力来抵抗蛋白质的吸附[14]. gemini的这种比CTAB更强的蛋白质吸附抑制能力可能与其更低的CMC和更长的疏水链有关系, 因为这些有利于形成更稳定的管壁涂层. 注: CTAB和18-8-18在水中的CMC分别为0.9和0.0115 mmol/L[36].
3.2 中间基对分离的影响
双子表面活性剂的中间基能够显著影响胶束的形貌与尺寸[32], 因此中间基也有可能对分离造成一定的影响. 如图2所示, 当中间基的碳原子数(s)由3增加到12时, 碱性蛋白质始终保持了较高的分离效
图2 中间基长度对蛋白质分离的影响
缓冲添加剂: 0.1 mmol/L 18-4-18 (a), 18-5-18 (b), 18-6-18 (c), 18-8-18 (d). 其他条件与图1相同
率(超过300000 plates/m), 但是酸性蛋白质只有在5≤s≤8的时候才能得到有效的分离(如图2(b)~(d)所示), 分离效率与CTAB相当[16]. 当s<4或s>8的时候, 酸性蛋白的分离较差甚至没有峰.
为了解释这个现象, 我们使用负染TEM详细研究了中间基长度对gemini胶束形貌的影响. 如图3所示, 18-s-18形成的均为圆形的胶束, 且中间基对胶束尺寸具有显著的影响: 当中间基较短时, 如s=4 (图3(a)和(d)), 胶束尺寸为(282±69) nm. 随着中间基长度增加, 分子中疏水空间增大, 有利于gemini分子的紧密堆积[28,37], 因此胶束的尺寸减小. 如18-6-18的胶束尺寸减小到(133±41) nm (图 3(b)和(e)). 当进一步增长中间基, gemini分子的疏水空间过大, 使分子的堆积变得松散, 因此胶束尺寸又开始增大. 如s= 10 (图3(c)和(f))时的胶束尺寸为(286±80) nm. gemini 胶束尺寸随着中间基的增长而先减小后增大的现象以前也有过类似的报道[38]. 基于以上的讨论, 可以看出较小的胶束尺寸比大的胶束更有利于蛋白质分离.
另一方面, 从图2中我们可以发现中间基对蛋白质淌度也有一定的影响. 特别是对细胞素c(峰4)和碳酸酐酶(峰5)影响尤为明显. 当s从4变到8时, 细
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图3 不同中间基长度的双子表面活性剂形成的胶束的负染TEM 照片及其相应的尺寸统计图
gemini 配制在10 mmol/L 磷酸盐 (pH 3.0) 中. (a) 0.1 mmol/L 18-4-18; (b) 0.1 mmol/L 18-6-18; (c) 0.1 mmol/L 18-10-18; (d)~(f)为(a)~(c)相对应的尺寸统计图. 尺寸信息基于大约200个胶束统计得出
草莓托胞素c 的电泳淌度从(2.85 ± 0.04) × 10−4变到(2.64 ±
0.03) × 10−4 cm 2·V −1·s −1, 而碳酸酐酶的电泳淌度从(2.68 ± 0.02) × 10−4变到了(2.73 ± 0.03) × 10−4 cm 2·V −1·s −1. 这导致细胞素c 和碳酸酐酶在s = 6时峰重叠了, 但是在s
≤5或s ≥8的时候得到了基线分离. 这说明不同中间基的gemini 和蛋白质具有不同的亲和作用, 因此能够
得到淌度不同的gemini/蛋白质复合物[14]. 由此可见,
中间基可以作为一个工具来对蛋白质的淌度进行微调, 从而选择合适的中间基长度可以得到理想的分离. 尽管淌度可调节的范围相对比较窄. 不过, 这仍然是双子表面活性剂相对于其他表面活性剂的一个优点, 因为在CE 分离中对蛋白质淌度的调节是非常有意义的[4].
3.3 表面活性剂浓度对分离的影响
深度水产接下来我们考察了gemini 浓度对分离的影响.
实验表明, 0.02 mmol/L 的18-8-18就可以非常高效地分离碱性蛋白质(N > 100 000 plates/m, 见图4(a)), 但是要想有效地分离酸性蛋白质, 则需要0.05 mmol/L
以上浓度的18-8-18(如图4(b)所示). 总的来说, 提高
gemini 浓度能够使更多的表面活性剂与蛋白质相结
合, 使gemini/蛋白质复合物与毛细管壁的静电排斥
力增强, 因而提高酸性蛋白的分离效果. 但是当gemini 浓度提高到0.2 mmol/L 以上时(图4(d)), 分离效率反而开始下降, 说明过高浓度的表面活性剂是不利于分离的, 因此存在一个最优的浓度. 另外, 提高gemini 浓度能够增加EOF [26]从而缩短分离时间.
而gemini 的浓度对分离的选择性则没有明显的影响.
所以, 权衡考虑分离效率和分析时间, 我们使用了0.1 mmol/L 为最佳的gemini 浓度.
3.4 缓冲组成对分离的影响
我们考察了缓冲pH 和离子强度对分离的影响.
缓冲pH 能够强烈地影响蛋白质和毛细管的荷电状态, 因此也能强烈影响蛋白质的分离效果. 如图5所示,
pH 2.8的时候, EOF 小很[26,27], 因此分离时间很长 (> 17 min). 当pH < 2.8的时候分离变得更差. 当pH 提高到3.0的时候, 迁移时间显著缩短, 且分离效果明
显提高. 继续提高pH 到3.2以上时, 碱性蛋白质能够保持较好的分离效果, 但是酸性蛋白质的分离开始变差(如胰酶抑制剂不能出峰). 所以, pH 3.0是一个
比较合适的缓冲pH. 另外, 我们在5~20 mmol/L 的磷酸缓冲中考察了缓冲离子强度的影响. 实验表明增加离子强度能显著增长蛋白质的迁移时间. 低浓度
离子电推进刘倩等: 双子表面活性剂及其保护的纳米金作为缓冲添加剂用于毛细管电泳蛋白质分离
图4 双子表面活性剂浓度对蛋白质分离的影响
18-8-18浓度: 0.02 mmol/L (a), 0.05 mmol/L (b), 0.1 mmol/L (c), 0.2 mmol/L (d). 分离电压, −15 kV. 其他条件与图1相同
图5 缓冲pH对蛋白质分离的影响
pH 2.8 (a), pH 3.0 (b), pH 3.2 (c), pH 3.4 (d). 其他条件与图4相同的缓冲盐不能使蛋白质得到基线分离, 而高浓度的缓冲盐则会使分离的效率下降. 因此, 我们使用了一个适中的浓度(10 mmol/L)作为最佳的缓冲浓度. 在此基础上, 我们还改变了毛细管的管径来消除研究过程中焦耳热可能带来的影响. 发现在25 μm的毛细管中的实验现象基本上与50 μm的毛细管类似, 最佳的缓冲浓度均为10 mmol/L.
表1给出了最优条件下蛋白质的重现性, 分离效率和回收率数据. 可以看到分离的结果还是令人满意的, 说明蛋白质的管壁吸附已经基本上被抑制了. 碱性蛋白质的分离效率比文献报道的DDAB的效率略差[39], 但是对于蛋白质分离来说仍然算是非常高的. 与CTAB 相比[14~16], 分离效率基本上差不多, 但是gemini消耗的表面活性剂的量要少很多, 而且对蛋白质淌度具有更强的可调控性. 另外我们还发现蛋白质的分离效率可以通过减少进样量和减小毛细管径来进一步增强. 例如, 如果使用25 μm内径的毛细管同时将进样气压和时间减小到2.0 kPa和3 s, 除BSA以外的蛋白质的分离效率可高达103000到683000 plates/m. 但是在这种情况下, 蛋白质的峰非常小, 使定量分析比较困难. 因此在下面的实验中, 我们仍然使用50 μm的毛细管, 3.4 kPa的进样压力以及5 s的进样时间.勇猛的圣灵肩垫
3.5 纳米粒子作为缓冲添加剂的研究
我们以前报道过双子表面活性剂18-s-18可以作为纳米金合成时的保护剂[28]. 而Tseng等人报道过纳米
金能够增强CE分离蛋白质的效果[31]. 这是因为纳米金能够通过赖氨酸和半胱氨酸残基上的巯基与蛋白质发生亲和作用. 基于这个现象, 本文进一步研究了使用gemini保护的金纳米粒子作为缓冲添加剂来分离蛋白质.
在CE中使用gemini@AuNPs的一个前提是它在缓冲条件下必须保持一定的稳定性. 我们使用了紫外可见光度计来对gemini@AuNPs在缓冲里面的稳定性进行表征. 如果纳米金发生聚集的话将会导致共振吸收的红移[40]. 以前有报道过柠檬酸保护的金纳米粒子在高盐或者低pH的条件下都不稳定[41], 而我们的实验表明, gemini@AuNPs在较高的缓冲浓度下(10~80 mmol/L磷酸盐)或者较广的pH范围(pH 3.0~9.0)内都非常稳定, 共振吸收峰的位置几乎没有
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