㊃论著㊃
基金项目：国家自然科学基金(81573735)；北京市自然科学基金(7142037)
作者单位:100010 首都医科大学附属北京中医医院北京市中医研究所[李梦杰(硕士研究生)㊁张蕾㊁周明学㊁李思耐㊁任攀(硕士研究生)㊁刘卫红]
烧结线作者简介：李梦杰(1993-)，女,2017级在读硕士研究生㊂研究方向：中西医结合心血管病研究㊂E⁃mail:limengjie_93@163
通信作者：刘卫红(1968-)，女，博士，博士生导师，研究员㊂研究方向：中医药防治心血管病的疗效评价及作
用机制研究㊂E⁃mail:wh.l-007@163
清血消脂方通过抑制CD36㊁SR⁃A 表达干预氧化三甲胺促进泡沫细胞形成的作用机制研究 李梦杰 张蕾 周明学 李思耐 任攀 刘卫红
【摘要】 目的 探讨清血消脂方对高脂高胆碱饮食喂养的ApoE 基因敲除(ApoE -/-)小鼠及泡
沫细胞内CD36㊁SR⁃A 表达的影响㊂方法 建立高脂高胆碱饮食饲养的ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化模型及氧化三甲胺促进泡沫细胞形成的细胞模型，采用RT⁃PCR 及Western blot 技术对小鼠肝脏和巨噬细胞内CD36㊁SR⁃A mRNA 和蛋白表达进行检测㊂结果 HE 染结果显示，高脂高胆碱饮食能够明显增加ApoE -/-小鼠主动脉斑块的面积，经过清血消脂方的干预之后，主动脉斑块的面积明显 减少㊂与模型组细胞相比较，清血消脂方能够显著降低泡沫细胞内胆固醇的含量(P <0.05)㊂RT⁃PCR 和Western blot 结果显示，清血消脂方能够显著降低小鼠肝脏和泡沫细胞内CD36㊁SR⁃A
mRNA 和蛋白的表达(P <0.05)㊂结论 清血消脂方可能通过抑制小鼠肝脏和泡沫细胞内CD36㊁SR⁃A mRNA 和蛋白的表达，减少巨噬细胞内胆固醇的摄入，抑制泡沫细胞的形成，从而阻止动脉粥
样硬化的进程㊂
【关键词】 动脉粥样硬化; 氧化三甲胺; 清血消脂方; 胆固醇摄入; CD36; SR⁃A 【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2018.10.008Mechanism of the action of Qingxue Xiaozhi decoction of promotin foam cell formation by inribitin the expression of CD36and SR⁃A LI Mengjie ,ZHANG Lei ,ZHOU Mingxue ,et al. Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine ,Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University ,Beijing 100010,China
Corresponding author :LIU Weihong ,E⁃mail :wh.1-007@163
泥浆固液分离【Abstract 】 Objective To investigate the effect of Qingxue Xiaozhi decoction on the expression of CD36and SR⁃A in ApoE gene knockout (ApoE -/-)mice fed by high fat and hypercholine diet and foam
cells.Methods The atherosclerotic model of ApoE -/-mice fed with high fat and high choline diet and the cell model of foam cells formed by trimethylamine and oxidized low density lipoprotein (ox⁃LDL)were es⁃
tablished.The expression of CD36,SR⁃A mRNA and protein in the liver of mice and macrophages was detected by RT⁃PCR and Western blot.Results The results of HE staining showed that high fat and hypercholine diet could significantly increase the area of aortic plaque in ApoE -/-mice.The area of athero⁃sclerotic plaque was significantly reduced after the intervention of Qingxue Xiaozhi decoction.The content of cholesterol in cells decreased significantly compared with the cells in the model group (P <0.01).
RT⁃PCR and Western blot results showed that the expression of CD36,SR⁃A mRNA and protein in liver
and foam cells could be significantly reduced by Qingxue Xiaozhi decoction (P <0.01).Conclusion
Qingxue Xiaozhi decoction can prevent the process of atherosclerosis possibly through inhibiting the expression of CD36,SR⁃A mRNA and protein in the liver and foam cells of mice,reduce the intake of cho⁃lesterol in macrophages and inhibit the formation of foam cells.
【Key words】 Atherosclerosis; Trimethylamine oxide; Qingxue Xiaozhi decoction; Cholesterol intake; CD36; SR⁃A
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病共同的病理生理基础，近年来，随着经济水平和人们生活方式的改变，其发病率亦呈逐年上升趋势㊂单核巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox⁃LDL)并吞噬大量脂质形成泡沫细胞，是动脉粥样硬化标志点，贯穿整个动脉粥样硬化的发生发展[1⁃3]㊂
在泡沫细胞形成过程中，巨噬细胞表面的清道夫受体SR⁃A和CD36是负责摄取氧化脂蛋白的主要受体[4]㊂近年研究表明氧化三甲胺作为心血管疾病的一种新的独立危险因素，可以通过增加CD36的表达来促进泡沫细胞的形成[5]㊂本研究以载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠和氧化三甲胺㊁ox⁃LDL诱导的泡沫细胞为研究对象，通过清血消脂方对小鼠肝脏内和对ox⁃LDL㊁氧化三甲胺诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞内CD36及SR⁃A mRNA和蛋白表达的影响，从基因和蛋白水平探讨清血消脂方干预AS泡沫细胞
形成的可能机制㊂
1 材料和方法
1.1 实验动物
8周龄健康雄性ApoE-/-小鼠48只，健康雄性C57BL/6小鼠16只，体重18~20g由北京维通利华实验动物技术有限公司提供㊂合格证号:SCXK (京)2012⁃0001㊂饲养环境:SPF级，相对湿度50%，室温22~24℃，光照时间7:00~19:00，自由采食摄水㊂动物实验处理均严格遵循动物福利原则及首都医科大学附属北京中医医院实验动物伦理委员会的要求㊂
1.2 实验药品
siv-011
高脂饲料:21%脂肪(WT/WT)㊁0.15%胆固醇(WT/WT)的标准西方饮食㊂添加胆碱高脂饲料：每千克西方饮食饲料添加胆碱10g(1.0%)㊂购于北京科奥协力饲料有限公司，许可证号:SCXK(京) 2009⁃0012㊂
清血消脂方(虎杖15g㊁大黄10g㊁蒲黄10g㊁姜黄10g㊁泽泻15g㊁萆薢10g㊁茵陈15g㊁白术12g㊁石菖蒲10g㊁红花5g，各味饮片由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供)㊂清血消脂方冻干粉由中国中医科学院中药研究所制备㊂机器型号:
LGJ⁃10B冷冻干燥机，军事医学科学院实验仪器厂研制，北京四环科学仪器厂有限公司制造㊂冷阱温度:-45℃㊂真空度:-0.1㊂
阿托伐他汀钙片(商品名：立普妥，辉瑞制药有限公司，国药准字:H20051408)
1.3 小鼠饲养与分组
适应性饲养3天后,C57小鼠设为正常对照组(C57+基础饲料)，将ApoE-/-小鼠随机分为三组，每组16只㊂模型组(ApoE-/-+高脂高胆碱饲料)㊁立普妥组(ApoE-/-+高脂高胆碱饲料+阿托伐他汀钙)㊁清血消脂方组(ApoE-/-+高脂高胆碱饲料+清血消脂等效剂量)㊂体重每周称取一次，造模12周，给药12周，给药组小鼠灌胃量按成人临床等效剂量换算成小鼠剂量，立普妥3mg/kg体重，清血消脂方4.541g/kg体重(折算系数为9.01，公式：成人日用量/60kg×9.01=小鼠日用量)㊂每日灌胃给药一次，正常对照组和模型组灌服等体积蒸馏水㊂实验过程中部分小鼠灌胃不耐授而死亡，故每组统一随机选取10只进行检测㊂
1.4 小鼠主动脉斑块病理学观察
麻醉处死小鼠，对此小鼠主动脉进行分离，放入4%多聚甲醛中固定过夜，脱水，包埋，制备5μm 组织切片，对切片进行HE染，对斑块进行病理学观察，拍照保存㊂
1.5 小鼠Raw264.7巨噬细胞的培养及分组
将密度为1×105个/mL的巨噬细胞接种到6孔板中，每孔中加入2mL10%FBS DMEM培养液，置于5%CO2饱和湿度㊁37℃恒温培养箱中培养24小时，然后将细胞进行同步化处理，分为正常组㊁ox⁃LDL组(正常细胞+80μg/mL ox-LDL)㊁模型组(正常细胞+80μg/mL ox⁃LDL+200μmol/L TMAO)㊁25μg/mL剂量组(正常细胞+80μg/mL ox⁃LDL+200μmol/L TMAO+25μg/mL清血消脂方)㊁50μg/mL 剂量组(正常细胞+80μg/mL ox⁃LDL+200μmol/L TMAO+50μg/mL清血消脂方)㊁100μg/mL剂量组(正常细胞+80μg/mL ox⁃LDL+200μmol/L TMAO+
100μg/mL清血消脂方)㊂每组3个复孔㊂
1.6 油红O染检测泡沫细胞脂滴形成情况
用PBS将细泡清洗3遍，用丙酮和甲醛固定液对细胞固定15分钟㊂室温固定㊂将细胞用PBS清洗3次㊂用60%异丙醇将细胞清洗一次㊂清洗细胞，加入油红O染料染10~15分钟㊂用PBS将细胞清洗3次㊂将细胞放在显微镜下进行观察并拍照㊂
1.7 采用胆固醇酶法对泡沫细胞内胆固醇的含量进行检测
将细胞用PBS洗涤两次，按照比例每1×106个细胞加0.1mL裂解液，混匀，静置10分钟㊂裂解液从培
养板中收集到EP管中，室温2000g离心5分钟，取上层清液用于酶学测定㊂取190μL工作液到96孔板中，加入不同浓度的标准品和组织样品，室温反应20分钟，根据OD值绘制标准曲线，计算胆固醇的浓度㊂
1.8 RT⁃PCR检测载脂蛋白E基因敲除小鼠肝脏和小鼠Raw64.7巨噬细胞内CD36和SR⁃A mRNA 的表达网络设备管理
每组选取10个肝脏样本中的3个进行检测㊂各目的基因引物序列均由北京Invitrogen公司合成㊂选用β⁃actin作为内参照㊂SR⁃A上游引物为5′⁃ATCTTCCACCAAGGCCAGTG⁃3′，下游引物为5′⁃CCTAGACTCCGGCAGACAAC⁃3′(83bp);CD36上游引物为5′⁃GGAGGCATTCTCATGCCAGT⁃3′，下游引物为5′⁃CTGCTGTTCTTTGCCACGTC⁃3′(176bp)；细胞总RNA提取及RT⁃PCR反应均采用RT⁃PCR检测细胞因子试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限公司)㊂收集细胞沉淀提取细胞总RNA，取1μg逆转录成cDNA，进行PCR扩增(所有操作均严格按照试剂盒说明书进行)㊂扩增条件: 94℃变性1分钟,58℃退火1分钟,72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延长7分钟㊂取各基因扩增产物10μL，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染，多功能紫外投射反射分析仪下观察并拍照，采用美国Kodak凝胶分析系统，应用1D Image Analysis Software进行产物灰度图像分析，以各基因与β⁃actin的电泳条带光密度值的比值作为各基因的相对表达量㊂
1.9 Western blot检测小鼠肝脏和小鼠Raw264.7巨噬细胞内CD36和SR⁃A蛋白的表达
使用含有1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解巨噬细胞，然后12000r/min离心15分钟，取上
清收集蛋白，以BCA法进行定量后测定蛋白浓度，将上样总蛋白调至一致㊂蛋白经10%SDS⁃PAGE 电泳分离后，以200mA恒流电转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐吐温缓冲溶液(TBST)封闭1小时，加入1∶1000稀释的SR⁃A抗体(ab183725)㊁1∶1000稀释的
CD36抗体(ab133625),4℃过夜，然后孵育相应二抗室温1小时，化学发光法显，成像扫描分析系统保存图像㊂
1.10 统计学处理
应用SPSS11.5软件对数据进行统计分析㊂计量资料经检验符合正态分布和方差齐，数据采用均数±标准差(x±s)形式表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法㊂以P<0.05为差异有显著性意义,P<0.01为差异有极显著性意义㊂
2 结果
2.1 清血消脂方对高脂高胆碱饮食小鼠体重的影响
小鼠经过高脂喂养12周，清血消脂方干预12周之后，与模型组相比较，清血消脂方组小鼠体重显著降低(P<0.05)㊂见表1㊂
表1 清血消脂方对高脂高胆碱饮食小鼠体重的影响(x±s,g)组别n体重
正常组1029.55±0.4241
模型组1033.52±0.9530a
立普妥组1029.93±0.5060b
清血消脂方组1029.87±0.5180b
注：与正常组比较,a P<0.05；与模型组比较,b P<0.05㊂
2.2 小鼠动脉粥样硬化模型的建立及清血消脂方的干预作用
高脂喂养12周之后小鼠主动脉斑块的面积明显增大，斑块内有大量的泡沫细胞聚集㊂经过清血消脂方干预12周后，与模型组小鼠相比较，清血消脂方组小鼠主动脉斑块的面积明显减少㊂见图1㊂
2.3 小鼠Raw264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及清血消脂方的干预作用
细胞培养完成后，结果显示，与ox⁃LDL组相比，模型组泡沫细胞的形成更多，说明氧化三甲胺能够促进泡沫细胞的形成，因此本实验的细胞模型建立成功㊂与模型组相比较，清血消脂方能够显著降低巨
噬细胞内脂滴的含量㊂见图2㊂
表2 清血消脂方对泡沫细胞内胆固醇含量的影响(x ±s ,n =3)
组别总胆固醇(μmol /L)
游离胆固醇(μmol /L)
胆固醇酯(μmol /L)
胆固醇酯/总胆固醇(%)
正常组9.53±1.4048.31±0.735 3.88±0.4310.321±0.044模型组
133.20±6.518a 55.99±0.736a 77.23±7.130a 0.577±0.026a 清血消脂方25μg /mL 组121.30±3.50353.90±1.57667.41±2.9190.556±0.012清血消脂方50μg /mL 组97.81±3.848b 46.40±1.636b 51.41±3.571b 0.525±0.020清血消脂方100μg /mL 组
75.97±2.246b
体验台41.16±1.136b
34.82±2.464b
0.457±0.022b
注：与正常组比较,a P <0.05；与模型组比较,b P <0.
05㊂
注:A：正常组;B：模型组;C：立普妥组;D：清血消脂方组
图1 小鼠动脉粥样硬化模型的建立及清血消脂方的干预作用
(HE×200)
注:A：正常组;B:ox⁃LDL 组;C：模型组;D:25μL /mL 组;E:50μL /mL 组;F:100μL /mL 组
图2 清血消脂方对巨噬细胞内脂滴含量的影响(油红O 染×200)
2.4 清血消脂方对泡沫细胞内胆固醇含量的影响
细胞培养完成后，结果显示，与模型组相比，清血消脂方50μg /mL 剂量组可显著降低泡沫细胞内总胆固醇㊁游离胆固醇的含量(P <0.05)，并且能够降低泡沫细胞内胆固醇酯的含量(P <0.05)㊂清血消脂方100μg /mL 剂量组可以显著降低泡沫细胞内总胆固醇㊁游离胆固醇及胆固醇酯的含量(P <0.05)，并且能够降低泡沫细胞内胆固醇酯与总胆固醇的比值,(P <0.05)㊂见表2㊂
2.5 清血消脂方对动脉粥样硬化小鼠肝脏中
CD36㊁SR⁃A mRNA 和蛋白表达的影响
经过清血消脂方干预12周之后，结果显示，与
模型组相比较，清血消脂方组小鼠肝脏中CD36
mRNA 和蛋白的表达显著降低(P <0.05)㊂与模型组相比较，清血消脂方组小鼠肝脏中SR⁃A mRNA 和蛋白的表达显著降低(P <0.05)㊂见表3㊁表4㊁
图3㊂
表3 清血消脂方对ApoE -/-小鼠肝脏内CD36㊁
SR⁃A mRNA 表达的影响(x ±s )
组别n CD36SR⁃A 正常组3 1.300±0.1080.760±0.039模型组3 4.240±0.188a 1.034±0.035a 立普妥组3 3.660±0.2470.819±0.040b 清血消脂方组
3
2.200±0.140b
0.788±0.030b
注：与正常组比较,a P <0.05；与模型组比较,b P <0.05㊂
表4 清血消脂方对ApoE -/-小鼠肝脏内CD36㊁
SR⁃A 蛋白表达的影响(x ±s )
组别n CD36SR⁃A 正常组
拉挤模具
30.273±0.0270.559±0.041模型组30.467±0.019a 0.719±0.028a 立普妥组30.404±0.0260.581±0.020b 清血消脂方组
3
0.246±0.011b
0.564±0.010b
注：与正常组比较,a P <0.05；与模型组比较,b P <0.05㊂
注:A：正常组;B：模型组;C：立普妥组;D：清血消脂方组
图3 清血消脂方对小鼠肝脏中CD36㊁SR⁃A 蛋白表达的影响
2.6 清血消脂方对巨噬细胞源性泡沫细胞模型内D36㊁SR⁃A mRNA 和蛋白表达的影响
经过清血消脂方之后，结果显示，与模型组相
比较，清血消脂方组细胞中CD36mRNA 和蛋白的表达显著降低(P <0.05)㊂与模型组相比较，清血消脂方组细胞中SR⁃A mRNA 和蛋白的表达显著降低(P <0.05)㊂见表5㊁表6㊁图4㊂
表5 清血消脂方对泡沫细胞内CD36㊁SR⁃A mRNA 相对表达量的影响(n =3,x ±s )
组别CD36SR⁃A 正常组 1.253±0.139 1.113±0.073模型组
2.123±0.154a 2.103±0.052a 清血消脂方25μg /mL 组 1.787±0.067 1.340±0.344清血消脂方50μg /mL 组 1.560±0.020b 1.680±0.185清血消脂方100μg /mL 组
1.377±0.160
b
1.500±0.050
b
注：与正常组比较,a P <0.05；与模型组比较,b P <0.05㊂
表6 清血消脂方对泡沫细胞内CD36㊁SR⁃A 蛋白相对表达量的影响(n =3,x ±s )
组别CD36SR⁃A 正常组0.164±0.0370.261±0.050模型组
0.414±0.035a 0.577±0.050a 清血消脂方25μg /mL 组0.304±0.0490.433±0.014清血消脂方50μg /mL 组0.252±0.030b 0.291±0.030b
清血消脂方100μg /mL 组
0.200±0.060
b
0.269±0.050b
注：与正常组比较,a P <0.05；与模型组比较,b P <0.
05㊂
注:A：正常组;B：模型组;C:25μg /mL 剂量组;D:50μg /mL 剂量组组;E:100μg /mL 剂量组
图4 清血消脂方对小鼠巨噬细胞中CD36㊁
SR⁃A 蛋白表达的影响
3 讨论
AS 是心脑血管疾病共同的病理学基础，也是导
致患者死亡的重要原因[6]㊂不健康的生活方式特别是不合理的膳食结构与动脉粥样硬化密切相关[7]㊂新的研究表明，膳食中的胆碱等食物在肠道菌参与下形成的氧化三甲胺是动脉粥样硬化新
的独立危险因素，在动脉粥样硬化的发生和发展的过程中扮演着十分重要的角[5,8⁃9]㊂从中医角度讲,AS 的中医病机多概括为本虚标实，本虚即气血虚衰，标实则痰浊㊁瘀血阻滞等，而以标实为多；在治法上，多采取益气活血㊁化痰祛浊之法，往往能取得较好疗效[10]㊂清血消脂方是本院国家级名老中医黄丽娟主任医师根据自己多年的临床经验，根据动脉粥样硬化由痰致瘀，痰瘀互结的关键病机，以祛浊活血为法组方制成的院内制剂，在临床上取得了较好的疗效㊂以往研究证明清血消脂方可
通过抗炎调节血脂等方面发挥抗动脉粥样硬化的作用㊂本研究旨在观察其干预AS 泡沫细胞形成的作用机制，为中医药抗AS 提供新的思路㊂
载脂蛋白E(ApoE)基因具有多种生物学功能，能够参与脂蛋白的转化与代谢过程㊂载脂蛋白E 基因敲除(ApoE -/-)小鼠在高脂条件下，短期内即可形成类似于人类的AS 病变而逐渐成为AS 研究中常用的动物模型[11⁃13]㊂因此本研究采用高脂高胆碱饮食的ApoE -/-小鼠制作动脉粥样硬化的模型㊂
结果显示，与模型组小鼠相比较，清血消脂方组小鼠的主动脉斑块面积显著减小，说明清血消脂方对动脉粥样硬化具有作用，这与之前的研究结果相一致[14]，同时，与模型组相比较，清血消脂方能够显著降低小鼠的体重㊂
泡沫细胞的形成是由巨噬细胞通过清道夫受体(SRS)摄取LDL 而开始的，是动脉粥样硬化重要的病理基础，贯穿动脉粥样硬化的始终[4]㊂SR⁃A 和CD36属于B 类清道夫受体㊂在泡沫细胞的形成过程中具有至关重要的作用[15]㊂清道夫受体SR⁃A 和CD36的表达直接影响到巨噬细胞内脂质的沉积情况，对巨噬细胞泡沫化具有重要的影响[16]㊂氧化三甲胺作为心血管疾病的一个新的独立危险因素，无论是在血管内还是血管外，都能够通过CD36依赖的MAPK /JNK 通路来增加巨噬细胞表面的清道夫受体的表达来促进氧化低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞的形成[17]㊂小鼠Raw 264.7巨噬细胞在氧化
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