ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｓｐｉｒｏｌａｃｔａｍ；ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｓ；ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ
ｌｌ
青岛科技大学研究生学位论文
第一章前言
１．１一氧化氮自由基（ＮＯ）
石膏增强剂活性氮（ＲＮＳ）是指一氧化氮自由基（ＮＯ）及其与活性氧等物质相互作用，衍生出的一系列包括ＯＮＯＯ‘及其质子形式过氧亚硝酸（ＨＯＯＮＯ）和三氧化二氮（Ｎ２０３）等具有高度氧化活性的自由基和硝基类化合物，它们作为ＮＯ的代谢产物广泛存在于各类生物组织中【ｌ，２Ｊ。
一氧化氮自由基（ＮＯ）在生命过程中发挥着重要的生理作用，它可以轻易的进入细胞内参与众多的生理过程，与生物体内存在的其它自由基相比，它是体积最小、质量最轻、结构最简单的信号传递因子。它产生于脊椎动物的多种组织和细胞，例如巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等，是在一氧化氮合
自由落体运动实验成酶（ＮＯＳ）的参与下，以Ｌ．精氨酸为底物，生成Ｌ．胍氨酸和一氧化氮【３＇４，５Ｊ。ＮＯ参与的生理过程包括：神经信号的传递，血液循环，生物组织的产生、分化、发育和衰亡，免疫系统调节，基体能量及物质循环，泌尿与肝脏解毒等诸多生理过程【６，７，引。另外，它还参与到生物体中细菌、病毒和肿瘤细胞的杀伤。当ＮＯ在人体内释放或调解失常就会诱导产生诸如偏头痛、高血压、偏头痛、动脉粥样硬化、局部缺血和糖尿病等疾病［９，１０，１１】。而且，ＮＯ作为一个“新奇”因素也参与到了植物的许多生理过程中，如延缓果实的成熟与衰老，促进叶片和根的生长发育，促进种子的休眠和需光种子的萌发，并在植物受到生物胁迫和非生物胁迫时参与其抗逆反应［１２，１３１。由于ＮＯ在生物体内有如此多的作用，因此ＮＯ的检测对研究其生理和病理机制具有的重要意。
１．２检测一氧化氮的方法
目前检测一氧化氮的方法主要有化学发光法（ＣＬ）、分光光度法、电化学法、电子顺磁波谱法（ＥＰＲ）、荧光法、质谱法和光声光普法。信号调理模块
１．２．１化学发光法１１４，１５Ｊ
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臭氧（０３）能将ＮＯ氧化成激发态的Ｎ０２＂，Ｎ０２。在返回基态时发射波长为６００－－３０００ｎｍ的光，因此通过检测发射光就可以实现对ＮＯ的定量测定。此方法具有较高的灵敏度，但是
此法只能用于检测气相中的ＮＯ。对于溶液中的ＮＯ需先用惰性气体将其抽提出来，但这样会使样品受到其它因素的干扰，因此该法所
荧光素内酰胺类分子荧光探针的合成及其在一氧化氮检测中的应用
测定的ＮＯ含量并不能完全代表组织细胞内的实际含量。
光纤环网过氧化氢（Ｈ２０２）能将ＮＯ氧化生成ＯＮＯＯ。，而ＯＮＯＯ。能够氧化３一氨基邻苯二甲酰肼（鲁米诺），使其呈激发态，当其返回基态时激发出强光，据此可以定量测定ＮＯ。由于Ｎ０３‘和Ｎ０２‘均不能激发这一反应，因此该法具有较好的特异性和灵敏度而被广泛应用于动物样品溶液中ＮＯ的检测。
１．２．２分光光度法［１６，１７］
ＮＯ易被氧化生成Ｎ０２。，在酸性环境下溶液中的Ｎ０２’可与格里斯（Ｇｒｉｅｓｓ）试剂发生重氮化反应，生成具有橙红的产物，该产物在波长５５０ｎｉｉｌ处有最大吸收峰，其吸光度与ＮＯ或Ｎ０２。的含量成正比，据此可以测定ＮＯ的量。但由于此法测定的是Ｎ０２一，所以是一种间接测定ＮＯ的方法，因此该法的选择性较差。
此外，还可以根据氧合血红蛋白（Ｈｂ０２）与ＮＯ反应生成高铁血红蛋白（ｍｅｔＨｂ）后，其最
大吸收波长会发生移动的原理，检测波长４０１ｎｉｎ和４２１ｎｉｎ处吸光度的变化来确定ＮＯ含量的变化。该法已广泛地用于检测植物体释放ＮＯ的研究。但除了ＮＯ，其它的活性氧也能与血红蛋白作用，因此该方法难以准确地检测ＮＯ的实际含量。
１．２．３电化学法【博ｊ
电化学法是直接测定ＮＯ的一种常用的方法，该方法主要包括氧化法、还原法和催化氧化法。其原理是根据ＮＯ易于失电子被氧化后会在正极发生电化学反应，因此通过测定反应所产生的氧化电流的大小来检测ＮＯ的浓度。该法可以实现对溶液中的ＮＯ进行实时在线检测，而且具有很高的灵敏度。但该法选择性不强，只适用于溶液中ＮＯ的检测。
１．２．４电子顺磁共振波谱法【１９，２０】
电子顺磁共振（ＥＰＲ）又称电子自旋共振（ＥＳＲ），常用来研究和检测含有未成对电子的顺磁性物质。因为ＮＯ含有一个未成对电子，因此可以用ＥＳＲ波谱对其进行测定。由于ＮＯ的半衰期短，仅为３～５秒，需要采用自旋捕集剂将其捕获形成稳定的配合物或自由基，常用的自旋捕获剂有亚铁配合物、有机化合物和血红蛋白（Ｈｂ）等。ＮＯ被捕获后会生成顺磁性物质，在外磁场作用下，未成对电子能级发生分裂，当电子分裂的能级差与外加的电磁波能量相等时，未成对电子即会发生跃迁，信号处理后显示在电子顺磁共振仪上，ＮＯ的含量与信号强度成正比，据此可测定ＮＯ的量。但
是该方法的不足之处是线性范围窄和设备昂贵。
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１．２．５荧光法１２１Ｊ
用荧光法能够测定细胞内ＮＯ的产生和空间分布，有灵敏度高和操作简便的特点，具有广阔的应用前景。但是此法仍有一些不足，如有些探针不能与ＮＯ直接作用，而是与ＮＯ氧化后的产物反应，所以荧光强度不仅与ＮＯ的含量有关，还与ＮＯ的氧化产率和浓度有关，并且不适用于缺氧条件下的检测。
１．２．６质谱法和光谱法【２２，２３，２４】
除了上述方法外，近年来光声光谱法和质谱法也常用于对Ｎ０的检测。Ｃｏｎｒａｔｈ等人【２２ｊ将限制性毛细管进样口和质谱仪膜进样口相结合组建了一种特效、快速、非侵入式的测定整个植物或各种组织器官内释放ＮＯ的方法。该法能够高效的区分氮同位素，并且能从同一样品中同时测出ＮＯ，０２以及其它气体。
光声光谱法是以光生效应为基础的一种吸收光谱分析技术，该技术也是一种非侵入式检测ＮＯ的方法。当用稳定的并能连续可调的单光（例如激光器或高压疝灯作光源）照射光声池中的样品时，激发态分子在８～１０ｓ或更短时间内发生非辐射跃迁，将所吸收到的光能转化成热能，然后热能会被封闭于系统内的填充气体所吸收并转化为气体分子的动能，在封闭系统内产生周期性的压力波动，这就是所谓的光声信号。光声信号可被灵敏的微声探测器检测到，随后经前置放大器放达，放大后的信号被数据系统进行处理后就得到光声信号强度随光波波长变化的曲线，根据该曲线就可实现样品的定量分析。该法在对植物体内ＮＯ的检测中显示出较高的重现性和较好的灵敏度。但是此方法能否真Ｊ下准确的测出目标细胞中ＮＯ的含量目前还不是很清楚，但是用该方法测定的ＮＯ释放速率能够反映ＮＯ的合成和反应速率。
１．３荧光探针［２５，２６］
荧光探针是建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础上，选择性的将分析对象的化学信息连续转化成分析仪器易测量的荧光信号的分子测量装置，荧光探针受到周围环境的影响，使其发生荧光发射发生改变，从而使人们了解周围环境的特征或者环境中存在的某种特定信息１２５Ｊ。荧光分子探针具有灵敏度高、选择性好、使用方便、不受外界电磁干扰等优点。因此荧光探针被广泛的用于生物体内的相关结构、物质及生命过程进行标记、识别或者荧光成像【２引。例如，一氧化氮本身不具备荧光信号，可以通过引入荧光探针与一氧化氮反应，生成与荧光探针自身光学性质不同的物质，然后通过
荧光探针性质的变化实现对一氧化氮进行定性和定量测试１２¨。
３
荧光素内酰胺类分子荧光探针的合成及其在一氧化氮检测中的应用
１．３．１荧光探针的组成
荧光探针至少有两部分组成：一是具有识别或反应的部分；另一部分是具有信号输出功能的部分。其中具有识别功能的部分可以是某种配体、药物或底物等小分子，或蛋白质和核酸等生物大分子，也可以是具有特异性识别功能的反应基团，例如氨基、羧基等，它们的作用是识别待检测的生物靶标。而信号输出功能的部分主要是含有能够发射荧光的物质，例如，罗丹明、荧光素、菁染料等，它们的作用是将探针检测到的生物学信息有光学的形式输出并记录下来１２７。。１．３．２作为荧光探针必须具备的条件【２８Ｊ
（１）探针与被检测的生物分子的某种特定基团或某一区域能够特异性结合，且结合后不易解离，在一般条件下比较稳定；（２）荧光量子产率始终比较高，当与被检测物结合后荧光量产率下降不多；（３）由于某些生物体内的物质具有背景荧光（或内源性荧光），所以荧光探针的荧光必须能与生物样品的背景荧光有所区别，探针荧光颜与背景荧光对比要明显，便于清晰的判断结果；（４）荧光
探针不能影响被研究生物分子的结构或特性，因为探针在很多情况下是用于天然生物条件下的体外样品或者生物活体组织的研究，这时的荧光信号反应的不仅仅是荧光分子本身的信息，同样也反映了周边环境的信息。而荧光探针分子只是放在靶向分子周围的一个微小信使分子，因此，理想的探针不能影响被研究大分子的结构和特性；（５）荧光探针要具有好的溶解性，溶解后不会与其它物质发生反应，并且要求荧光探针无毒或低毒性。
１．３．３荧光分子探针的设计原理
荧光分子探针的设计原理主要有键合．信号输出法，置换法和化学计量法。１．３．３．１键合一信号输出法
键合．信号输出法（如图１．１所示）是指将探针中的识别基团与发光基团采用共价键结合起来设计荧光探针的手段。当识别基团与被分析物结合时能够导致荧光基团所处的化学条件发生改变，通过激发或发射波长的移动、颜的变化、荧光强度的增加或减小等现象来表现，这些变化可通过仪器识别或者裸眼进行观察。此方法是目前在荧光探针的设计中应用最广泛的方法。
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