一种抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂的制作方法

1.本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂。

背景技术：

2.蛙病毒属(ranavirus)被称为“冷血动物杀手”，宿主范围广泛，可感染鱼类、两栖类、爬行类等近百种水生生物。大口黑鲈(micropterus salmoides)是我国一种优质的淡水养殖鱼类，由大口黑鲈蛙病毒(largemouth bass ranavirus,lmbv)引起的大口黑鲈溃疡性疾病，流行范围广、发病率与致死率较高，严重威胁了我国大口黑鲈养殖业的发展。因此，寻安全、高效和低毒的抗大口黑鲈蛙病毒药物成为亟待解决的问题。

技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，该中药制剂可以在体内抑制大口黑鲈蛙病毒增殖，降低大口黑鲈蛙病毒的发病率，促进鱼体自愈。
4.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，所述中药制剂包括绿原酸、檞皮苷、香豆素、芒果酸、哈巴依苷、表告依春、黄芩苷、厚朴酚、桔梗皂苷、金丝桃素、白藜芦醇、大黄、木犀草素、苦鬼中的至少一种。
5.优选地，所述中药制剂为槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素。
6.发明人选取大口黑鲈蛙病毒作为模式病毒，以鲤鱼上皮细胞系为依托，发现绿原酸、檞皮苷、香豆素、芒果酸、哈巴依苷、表告依春、黄芩苷、厚朴酚、桔梗皂苷、金丝桃素、白藜芦醇、大黄、木犀草素、苦鬼中的至少一种组成的中药制剂，在体内和体外可以抑制lmbv增殖，降低了lmbv的发病率，促进鱼体自愈。其中，槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素组合的中药制剂能显著抑制lmbv增殖。
7.优选地，所述槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝8-32:8-32:4-8:2-4:1。
8.槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比会影响中药制剂的效果，发明人经过研究发现，当槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝8-32:8-32:4-8:2-4:1时，能够更好的抑制lmbv增殖，降低lmbv的发病率。
9.优选地，所述槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝16-32:16-32:8:2-4:1。在上述比例下，中药制剂的效果更好。
10.优选地，所述槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝16:16:8:2:1。在上述比例下，中药制剂的效果最佳，lmbv的发病率降低了40％。
11.优选地，所述中药制剂的应用方式为：将中药制剂添加到饲料中。
12.优选地，所述复方中药制剂的添加量为10g制剂每kg饲料。
13.优选地，所述中药制剂的体外细胞抗病毒安全浓度为：绿原酸100μg/ml、檞皮苷50μg/ml、香豆素50μg/ml、芒果酸50μg/ml、黄芩苷25μg/ml、哈巴俄苷25μg/ml、表告依春25μg/ml、厚朴酚6.25μg/ml、桔梗皂苷1.5625μg/ml、金丝桃素3.125μg/ml、白藜芦醇0.78125μg/ml、大黄0.78125μg/ml、木犀草素0.78125μg/ml、苦鬼0.78125μg/ml。
14.优选地，所述细胞为鲤鱼上皮细胞系。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
16.1、发明人选取大口黑鲈蛙病毒作为模式病毒，以鲤鱼上皮细胞系为依托，发现绿原酸、檞皮苷、香豆素、芒果酸、哈巴依苷、表告依春、黄芩苷、厚朴酚、桔梗皂苷、金丝桃素、白藜芦醇、大黄、木犀草素、苦鬼中的至少一种组成的中药制剂，在体外可以抑制lmbv增殖。
17.2、发明人发现槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素组合的中药制剂能显著抑制lmbv增殖，lmbv的发病率降低了40％，促进鱼体自愈。
18.3、本发明的中草药制剂为大口黑鲈蛙病毒防控提供了新的方法，为渔药的开发提供了新的思路。
附图说明
19.图1为中药提取物对epc细胞最大安全浓度的测定结果图；其中1为甘草酸，2为绿原酸，3为檞皮苷，4为连翘苷，5为香豆素，6为栀子苷，7为芒果酸，8为哈巴依苷，9为表告依春；
20.图2为中药提取物对epc细胞最大安全浓度的测定结果图；其中10为黄芩苷，11为虎杖苷，12为柠檬苦素，13为牛蒡子甙，14为厚朴酚，15为桔梗皂苷，16为金丝桃素，17为白藜芦醇，18为大黄；
21.图3为中药提取物对epc细胞最大安全浓度的测定结果图；其中19为木犀草素，20为苦鬼；
22.图4为20种中药提取物体外对lmbv复制的影响检测结果图；其中*表示抑制lmbv复制药效相对较好的药物；1为甘草酸，2为绿原酸，3为檞皮苷，4为连翘苷，5为香豆素，6为栀子苷，7为芒果酸，8为哈巴依苷，9为表告依春，10为黄芩苷，11为虎杖苷，12为柠檬苦素，13为牛蒡子甙，14为厚朴酚，15为桔梗皂苷，16为金丝桃素，17为白藜芦醇，18为大黄，19为木犀草素，20为苦鬼；
23.图5为5种中药提取物配制的中药制剂体外对lmbv复制的影响检测结果图；
24.图6为5种中药提取物配制的中药制剂体内对lmbv的作用检测结果图；其中a为lmbv在肝脾中的增殖情况，b为lmbv的发病率；
25.图7为攻毒后不同时间点鱼体的临床症状图。
具体实施方式
26.下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1
28.1、材料和方法
29.1.1细胞和病毒
30.鲤鱼上皮细胞系(epc)采购自中国典型培养物保藏中心；大口黑鲈蛙病毒(lmbv)由本实验分离及保存，lmbv的分离：取病鱼组织样品100mg加入1ml pbs进行研磨，向匀浆液中加入浓度为1
31.μg/ml的双抗(青霉素和链霉素)，在4℃冰箱孵育2-4h后，4℃离心机8000rpm离心20min，用0.22μm滤器过滤收取上清液。取出铺满单层的细胞，倒掉培养基，用pbs润洗两遍，加入100倍稀释的组织过滤液，28℃孵育1h，补加含5％fbs的l-15，置于28℃培养箱中继续培养。观察细胞是否产生细胞病变效应(cytopathiceffect，cpe)。若产生cpe，待细胞脱落后，收取病毒液分装于离心管中，通过qpcr检测lmbv，对产生cpe现象且检测为lmbv的毒株，传代3次；将确定为lmbv的毒株置于-80℃冰箱保存。
32.1.2主要试剂及中药提取物
33.l-15培养基和胎牛血清均购自thermo scientific hyclone，celltiter96@aqueous one solution reagent购自promega公司
34.甘草酸、绿原酸、檞皮苷、连翘苷、香豆素、栀子苷、芒果酸、哈巴依苷、表告依春、黄芩苷、虎杖苷、柠檬苦素、牛蒡子甙、厚朴酚、桔梗皂苷、金丝桃素、白藜芦醇、大黄、木犀草素、苦鬼20种中药提取物购自成都曼思特生物科技有限公司。
35.1.3 20种中药提取物对epc细胞最大安全浓度的测定
36.将甘草酸、绿原酸、檞皮苷、连翘苷、香豆素、栀子苷、芒果酸、哈巴依苷、表告依春、黄芩苷、虎杖苷、柠檬苦素、牛蒡子甙、厚朴酚、桔梗皂苷、金丝桃素、白藜芦醇、大黄、木犀草素、苦鬼20种中药提取物，用含有2％二甲基亚砜(dmso)的l-15培养基分别配制成2mg/ml。使用前再以含5％fbs的l-15培养基将20种中药提取物均以2倍倍比稀释为合适的5个浓度(如图1,2,3)，将epc细胞接种至96孔板，待长满单层，弃掉培养液，分别加入20种中药提取物，每孔100μl，每个稀释度4个重复；同步设置空白细胞对照，28℃温箱培养，每天观察epc细胞的形态及生长情况。培养72h后采用celltiter96@aqueous one solution reagent试剂盒检测细胞活力，即每孔加入20μlcelltiter 96@aqueous one solution reagent，在28℃温箱中孵育4h，测定d
490nm
值；计算不同浓度中药对细胞的安全浓度。计算公式为：细胞活率＝(药物组d
490nm
值/细胞对照组d
490nm
值)。
37.1.4 20种中药提取物体外对lmbv的抑制作用
38.根据测定的20种中药提取物的安全浓度，取单层epc细胞的12孔板，分别加入l-15培养基稀释至各药物的安全浓度，l-15培养基作对照，每孔500ul,每个药物3个重复，加入后放细胞培养箱27℃作用3小时；弃掉液体，用pbs漂洗，每孔加入500ul稀释到安全浓度的中药和病毒混合液(tcid
50
＝10-4
/孔)，放入细胞培养箱27℃作用2小时；弃掉液体，用pbs漂洗，加入500ul含相应浓度中草药的2％fbs l-15维持液，放入27℃细胞培养箱培养观察，待对照病变80％时，收取病毒样品；利用上述收取的病毒液，重复本实验3次，连续作用三次后，测定半数组织培养感染剂量(tcid
50
)。
39.1.5槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素5种中药提取物配制的中药制剂体外对lmbv的抑制作用
40.在5种中药提取物都抗lmbv的基础上，根据各个药物的最大安全浓度配制中药制剂，分别以l-15培养基作为空白对照；槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝8:8:4:2:1(drug1)；槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝16:16:8:2:1(drug2)；槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝32:32:8:4:1(drug3)5种药物最大安全浓度组合混合。每孔加入500ul药物混合液，每孔三个重复，在27℃下孵育细胞3小时。弃掉液体，用pbs漂洗，加入500ul稀释好的中药和病毒混合液(tcid
50
＝10-4
/孔)，放入细胞培养箱27℃作用2小时；弃掉液体，用pbs漂洗，加入500ul含相应浓度中药提取物的2％fbs l-15维持液，放入27℃细胞培养箱培养观察，待对照病变80％时，收取病毒样品；利用上述收取的病毒液，重复本实验3次，连续作用三次后，测定半数组织培养感染剂量(tcid
50
)。
41.1.6槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素5种中药提取物配制的中药制剂体内对lmbv的抑制作用
42.取30尾9-10cm大口黑鲈，分为对照组和实验组，每组为15尾。将槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素按照质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝16:16:8:2:1进行配比，得到中药制剂，以10g中药制剂/1000g饲料的比例将中药制剂混合到饲料，3g/次，2次/天。对照组喂食正常饲料3g/次，2次/天，连续喂养一周后浸泡攻毒，3.5ml病毒液稀释于15l水中(病毒液lgtcid
50
＝8.5)，30尾鱼分别浸泡30min，捞回至各自缸中，2缸/组。观察记录发病症状。
43.2结果
44.2.1中药提取物对epc细胞最大安全浓度的测定
45.不同中药提取物对epc细胞会产生不同的毒性，药物浓度越大，对细胞的毒性越大，d490nm值越小。为了测定中药提取物体外抗病毒的作用，需预先测定中药对epc细胞的最大安全浓度，避免药物自身毒性对epc细胞生长产生影响。二十种中药提取物在大浓度时会造成epc细胞折光性增强、变圆、皱缩、破碎和脱落。mts法计算的不同浓度中药对细胞活率的影响，结合细胞的病变效应(cpe)，确定各中药提取物的最大安全浓度。结果如表1和图1-3所示。
46.表1
[0047][0048][0049]
2.2各中药提取物体外对lmbv的抑制作用
[0050]
对20种中药提取物的最大安全浓度作用下lmbv tcid
50
的进行测定，结果如图4所示，从图4中可以看出，绿原酸、檞皮苷、香豆素、芒果酸、哈巴依苷、表告依春、黄芩苷、厚朴酚、桔梗皂苷、金丝桃素、白藜芦醇、大黄、木犀草素、苦鬼等14种中药提取物对lmbv具有抑制作用，其中槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素5种中药提取物的抑制作用最佳。
[0051]
2.3槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素5种中药提取物配制的中药制剂体外对lmbv的抑制作用
[0052]
由槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素组成的中药制剂，分别按照质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝8:8:4:2:1(drug1)、16:16:8:2:1
(drug2)、32:32:8:4:1(drug3)配制成的复方中药制剂，对复方中药制剂作用的lmbv测定tcid
50
，发现当槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝16:16:8:2:1时配制的中药复方制剂，在体外可以显著抑制lmbv复制(如图5所示)。
[0053]
2.4槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素5种中药提取物配制的中药制剂体内对lmbv的抑制作用
[0054]
动物实验结果表明，对照组和药物组攻毒后均无死亡。对照组攻毒后第4天开始出现临床病变，7-9天发病达到高峰，其中12尾呈现lmbv典型临床症状，如烂身、烂第一背鳍，烂尾，烂下唇。而药物组第4天也开始出现临状症状，7-9天临状症状达到高峰，6尾呈现lmbv的典型症状，如烂身，烂下唇，烂第一背鳍(如图7所示)。对照组和药物组攻毒10天后开始症状减轻，攻毒后第十三天药物组鱼体无任何临状症状，而对照组还有部分鱼呈现点状烂身(如图7所示)。对照组的发病率是药物组发病率的2倍，通过q-pcr测定肝脾内脏中lmbv的含量，发现药物组的基因组copies显著低于对照组(如图6所示)。上述结果说明复方中药制剂可以在一定程度上抑制lmbv复制，显著降低lmbv的发病率，促进鱼体自愈。
[0055]
最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：

1.一种抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂包括绿原酸、檞皮苷、香豆素、芒果酸、哈巴依苷、表告依春、黄芩苷、厚朴酚、桔梗皂苷、金丝桃素、白藜芦醇、大黄、木犀草素、苦鬼中的至少一种。2.如权利要求1所述抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂为槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的混合物。3.如权利要求2所述抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，其特征在于，所述槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝8-32:8-32:4-8:2-4:1。4.如权利要求3所述抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，其特征在于，所述槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝16-32:16-32:8:2-4:1。5.如权利要求4所述抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，其特征在于，所述槲皮苷、香豆素、哈巴依苷、厚朴酚和金丝桃素的质量比为槲皮苷：香豆素：哈巴依苷：厚朴酚：金丝桃素＝16:16:8:2:1。6.如权利要求1-5任一项所述抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂的应用方式为：将中药制剂添加到饲料中。7.如权利要求6所述抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂的添加量为10g制剂每kg饲料。8.如权利要求1-5任一项所述抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂的体外细胞抗病毒安全浓度为：绿原酸100μg/ml、檞皮苷50μg/ml、香豆素50μg/ml、芒果酸50μg/ml、黄芩苷25μg/ml、哈巴俄苷25μg/ml、表告依春25μg/ml、厚朴酚6.25μg/ml、桔梗皂苷1.5625μg/ml、金丝桃素3.125μg/ml、白藜芦醇0.78125μg/ml、大黄0.78125μg/ml、木犀草素0.78125μg/ml、苦鬼0.78125μg/ml。9.如权利要求8所述抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，其特征在于，所述细胞为鲤上皮细胞。

技术总结

本发明公开了一种抗大口黑鲈蛙病毒的中药制剂，属于中药技术领域。所述中药制剂包括绿原酸、檞皮苷、香豆素、芒果酸、哈巴依苷、表告依春、黄芩苷、厚朴酚、桔梗皂苷、金丝桃素、白藜芦醇、大黄、木犀草素、苦鬼中的至少一种。本发明的中药制剂可以明显抑制大口黑鲈蛙病毒复制，显著降低大口黑鲈蛙病毒的发病率，促进鱼体自愈。体自愈。体自愈。