一种仿生界面多层复合神经支架及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及医用生物材料领域，特别是涉及一种仿生界面多层复合神经支架及其制备方法与应用。

背景技术：

2.组织缺损的再生修复是被广泛关注的问题，因供区选择受限、供区的功能障碍等原因，自体组织移植存在一定局限性；同时，因来源不足、免疫排斥等原因，同种异体组织移植，也面临着诸多问题。组织工程学研究要素之一为：可供细胞进行生命活动的支架材料，支架材料在组织工程研究中可提供人工细胞外基质，构建支持体系，促进细胞黏附增殖、新陈代谢、形成新组织。神经支架有中空、多通道、可降解材料填充等结构，管壁分为单层和多层，导管材料主要为蛋白质类(例如丝素、胶原)和多糖类(例如明胶、壳聚糖、纤维素)等天然材料以及脂肪多元脂类、导电及非导电聚合物及水凝胶材等人工材料。目前，利用神经支架或导管修复神经缺损促进再生研究取得了一定的进展，但在此过程中，神经的低效率生长和高水平的疤痕浸润却是修复周围神经损伤需要解决的问题。现有技术中的修复策略都致力于提供一个生物相容性的导管或支架表面，但仍然没有很好的效果。
3.因此，如何建立一个类似细胞外基质的微环境并减轻再生过程中的疤痕浸润以实现更佳的神经再生是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种仿生界面多层复合神经支架及其制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.一种仿生界面多层复合神经支架，所述多层复合神经支架为中空管形，包括内层和外层；
7.所述内层为类细胞外基质水凝胶，厚度为0.5-1mm；
8.所述外层为生物响应性可降解材料薄膜，厚度为0.5-1mm；
9.所述多层复合神经支架内径为0-2.6mm，外径为4.6-6.6mm。
10.一种仿生界面多层复合神经支架的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)将生物响应性可降解材料溶解于二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，然后在正负高压条件下进行静电纺丝，得到生物响应性可降解材料薄膜；
12.(2)将类细胞外基质与n-乙酰基-5甲氧基胺加入水中溶解，并持续搅拌6-8h直至混合均匀，然后将溶液转移至基板均匀铺开，再向其中加入氯化钙溶液至覆盖水凝胶表面，得到类细胞外基质水凝胶；其中，基板优选为六孔板；
13.(3)将所述类细胞外基质水凝胶卷为管形，并将所述生物响应性可降解材料薄膜覆于所述类细胞外基质水凝胶外表面，得到所述仿生界面多层复合神经支架。
14.更为优选的，所述仿生界面多层复合神经支架为中空管形。
15.有益效果：本发明建立一个类似细胞外基质微环境的内层，促进神经高效率生长，同时建立一个相对坚硬的生物相容性疏水界面，从而避免高水平的疤痕浸润，内层和外层相结合形成仿生界面多层复合神经支架。本发明中的仿生界面多层复合神经支架内外分层，外硬内软，在支架内部制造一个柔软的亲水界面，模拟细胞外基质微环境，利于细胞粘附和迁移；同时在支架外层创造相对坚硬的疏水界面，以满足长期神经再生中对结构完整性的机械需求，防止成纤维细胞附着或渗透，从而避免疤痕的形成。
16.优选的，步骤(1)中所述生物响应性可降解材料、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺的添加量之比为1.5g:7ml:3ml。
17.优选的，所述生物响应性可降解材料包括聚乳酸、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或几种。
18.有益效果：本方案采用的生物响应性可降解材料具有优异的安全性、生物相容性。通过美国fda认证的生物响应性可降解材料，可用于临床；其中聚己内酯相关产品—“注射用聚己内酯微球面部填充剂”已获我国国家药监局审批。
19.优选的，步骤(2)中所述静电纺丝条件为：正高压12kv负高压-4kv。
20.有益效果：上述条件能够提供电场补充，提高纺丝效率，提升纤维拉升取向，有利于纤维更集中地沉积在接收区域。
21.优选的，步骤(2)中所述类细胞外基质物质、n-乙酰基-5甲氧基胺和水的添加量之比为0.224g：0.056g：5.6ml。
22.所述氯化钙溶液浓度为0.1mol/l。
23.优选的，所述类细胞外基质包括纤维素、藻酸盐、透明质酸、胶原、聚l-赖氨酸、聚l-谷胺酸中的一种或几种。
24.有益效果：本发明中的类细胞外基质物质均采用天然物质，具有良好的生物相容性、生物降解性和重塑能力，能够更好支持细胞迁移、增殖、分化和黏附，也大大减小了毒副作用。
25.一种仿生界面多层复合神经支架在引导神经及神经相关肌肉肌腱组织再生的医疗器械中的应用。
26.本发明公开了一种仿生界面多层复合神经支架及其制备方法与应用，本发明根据神经再生微环境要求及毗邻结构设计，构建神经再生通道引导神经再生，同时进行界面差异化设计，促进神经生长并减轻疤痕浸润，并且，本发明采用生物响应性可降解材料制备相对坚硬的疏水界面外层，构建再生空间以满足长期神经再生中对结构完整性的机械需求，防止成纤维细胞附着或渗透，从而避免疤痕的形成且进一步抗组织粘连。另外，本发明采用类细胞外基质微环境材料制备柔软的内层，模拟细胞外基质微环境，由生物活性物质n-乙酰基-5甲氧基胺和类细胞外基质物质构成，具有促进再生界面细胞增值黏附、抗炎、成血管的功能。本发明具有优异的安全性、生物相容性，采用获美国fda认证的生物响应性可降解材料，能够用于临床，且类细胞外基质物质均采用天然物质，大大减小了毒副作用。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施
例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为实施例1中静电纺丝制备流程图；
29.图2为实施例1多层复合神经支架制备的设备原理示意图；
30.图3为实施例1多层复合神经支架的截面扫描电镜图；
31.图4为实施例1多层复合神经支架的差异化界面扫描电镜图；
32.图5为实施例1多层复合神经支架外层拉伸模量的应力-应变曲线图；
33.图6为动物模型进行体内验证；
34.其中，a为本发明实施例1提供的复合神经支架干预组，b为聚己内酯神经支架组，c为自体神经移植组。
具体实施方式
35.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
37.实施例1
38.一种仿生界面多层复合神经支架的制备方法，利用静电纺丝进行制备，包括以下步骤：
39.1)室温下，将1500mg聚己内酯溶解于7ml二氯甲烷和3ml n,n-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，搅拌至全部溶解，然后将混合溶液在正高压12kv，负高压-4kv条件下进行静电纺丝，纺丝完毕后，截取15mm*15cm的长方形纺丝膜，得到聚己内酯静电纺丝膜；
40.2)分别称取0.224g藻酸盐和0.056gn-乙酰基-5甲氧基胺，并置于容器中，加入5.6ml水溶解，使用磁力搅拌器搅拌过夜至均匀，然后使用1ml注射器吸取0.2ml溶液至六孔板中均匀铺开，再加入3ml左右0.1m的氯化钙水溶液作为交联剂，加至能够完全覆盖整个水凝胶，即得到类细胞外基质藻酸盐水凝胶；
41.3)将负载有类细胞外基质藻酸盐水凝胶和聚己内酯静电纺丝膜使用直径为2.6mm圆棒分别卷入，形成内水凝胶外纺丝膜的圆筒形仿生界面多层复合神经支架。
42.对比例1
43.一种聚己内酯神经支架的制备方法，包括以下步骤：
44.将实施例1步骤(1)中所得聚己内酯静电纺丝膜使用直径为2.6mm圆棒卷入，形成圆筒形神经支架。
45.技术效果
46.一、由图3和4的扫描电子显微镜可见，纳米纤维较直且呈多层堆叠，为导管外层提供了良好的力学性能的基础，能够防止导管接入神经中因结构性能问题引起的导管自身塌缩导致影响神经修复。
47.二、拉伸模量的应力-应变曲线
48.将实施例1步骤(1)得到的聚己内酯静电纺丝膜裁剪为长方形(35mm
×
12.5mm,l
×
w)后，使用动态热机械分析仪(dma q850/ta/china)进行拉伸模量测定。dma机器设定3mm
·
min-1
的拉伸速度，在室温下进行测定。应力-应变曲线由origin绘制，弹性区间内斜率即为拉伸模量。
49.结果如图5所示，显示了dma进行拉伸时的应力-应变曲线。通过斜率分析得到聚己内酯静电纺丝膜的拉伸模量为3.12
±
0.06mpa(n＝3)，聚己内酯静电纺丝膜的抗拉强度较好。并且可以看出在聚己内酯静电纺丝膜拉伸阶段始终表现出“胡克弹性”行为，经过屈服点之后直接断裂，说明神经导管外膜的纺丝局部排列较好，能够沿着排列方向忽然断裂。
50.三、动物实验：
51.(1)验证试验设计：
52.spf级雄性sprague-dawly(sd)大鼠(体重200-250g)随机分为3组，每组5只：
53.a组：多层复合神经支架组(使用实施例1得到的产品)；
54.b组：聚己内酯神经支架组(对比例1所得产品)；
55.c组：自体神经移植组。
56.(2)方法和过程：
57.饲养条件：温度21℃-25℃，湿度50％-60％。将三组大鼠麻醉后在无菌条件下，取右大腿及臀部后正中切口游离分离暴露坐骨神经，分别将坐骨神经中段切除10mm神经，制备坐骨神经缺损模型，a、b、c三组分别使用各自的神经支架桥接修复，支架两端分别利用显微缝线将神经外膜和支架缝合。
58.(3)技术信息：
59.单一聚己内酯神经支架没有差异化界面设计，并且没有类细胞外基质水凝胶内层(即没有类细胞外基质物质和n,n-二甲基甲酰胺)，进而促神经生长效果不佳。图6为a、b、c三组动物模型进行体内验证的he染图片，从组织学角度来分析两组再生神经纤维的差异。可以看出多层复合神经支架组和自体神经移植组再生神经优于聚己内酯神经支架组(实验动物样本量(sd大鼠只数)n＝5)。
60.本发明通过构建sd大鼠10毫米坐骨神经缺损模型，本发明实施例1所得仿生界面多层复合神经支架干预后，坐骨神经功能指数和神经电生理指标均有提高，可以得知本发明提供的多层复合神经支架可以改善神经功能能力。同时，n-乙酰基-5甲氧基胺和类细胞外基质物质原料作用，也使得炎症和氧化应激水平下降。
61.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：

1.一种仿生界面多层复合神经支架，所述多层复合神经支架为中空管形，其特征在于，包括内层和外层；所述内层为类细胞外基质水凝胶，厚度为0.5-1mm；所述外层为生物响应性可降解材料薄膜，厚度为0.5-1mm；所述多层复合神经支架内径为0-2.6mm，外径为4.6-6.6mm。2.如权利要求1所述的一种仿生界面多层复合神经支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将生物响应性可降解材料溶解于二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，然后在正负高压条件下进行静电纺丝，得到生物响应性可降解材料薄膜；(2)将类细胞外基质与n-乙酰基-5甲氧基胺加入水中溶解，并持续搅拌6-8h至混合均匀，然后将溶液转移至基板均匀铺开，再向其中加入氯化钙溶液至覆盖水凝胶表面，得到类细胞外基质水凝胶；(3)将所述类细胞外基质水凝胶卷为管形，并将所述生物响应性可降解材料薄膜覆于所述类细胞外基质水凝胶外表面，得到所述仿生界面多层复合神经支架。3.根据权利要求2所述的一种仿生界面多层复合神经支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述生物响应性可降解材料、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺的添加量之比为1.5g:7ml:3ml。4.根据权利要求3所述的一种仿生界面多层复合神经支架的制备方法，其特征在于，所述生物响应性可降解材料包括聚乳酸、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或几种。5.根据权利要求2所述的一种仿生界面多层复合神经支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述静电纺丝条件为：正高压12kv负高压-4kv。6.根据权利要求2所述的一种仿生界面多层复合神经支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述类细胞外基质物质、n-乙酰基-5甲氧基胺和水的添加量之比为0.224g：0.056g：5.6ml；所述氯化钙溶液浓度为0.1mol/l。7.根据权利要求6所述的一种仿生界面多层复合神经支架的制备方法，其特征在于，所述类细胞外基质包括纤维素、藻酸盐、透明质酸、胶原、聚l-赖氨酸、聚l-谷胺酸中的一种或几种。8.如权利要求1所述的一种仿生界面多层复合神经支架在引导神经及神经相关肌肉肌腱组织再生的医疗器械中的应用。

技术总结

本发明公开了一种仿生界面多层复合神经支架，所述多层复合神经支架为中空管形，属于医用生物材料技术领域，包括内层和外层；所述内层为类细胞外基质水凝胶，厚度为0.5-1mm；所述外层为生物响应性可降解材料薄膜，厚度为0.5-1mm；所述多层复合神经支架内径为0-2.6mm，外径为4.6-6.6mm。本发明还公开了一种仿生界面多层复合神经支架利用静电纺织进行制备的方法，还公开了一种仿生界面多层复合神经支架在引导神经再生的医疗器械中的应用。本发明具有优异的安全性、生物相容性，采用获美国FDA认证的生物响应性可降解材料，能够用于临床，且类细胞外基质物质均采用天然物质，大大减小了毒副作用。大减小了毒副作用。大减小了毒副作用。