第47卷第3期2021年5月吉林大学学报(医学版)
Journal of Jilin University(Medicine Edition)
Vol.47No.3
May2021
770
［文章编号］1671-587X(2021)03-0770-07DOI：10.13481/j.1671-587X.20210330
检测B-CTX和N-MID水平的双标记时间分辨免疫荧光分析 方法的建立和评价
毛骞1，陈翠翠2，梁焕坤2，刘鹏娥2，钟树海2，李来庆2
(1.北华大学附属医院内分泌科，吉林吉林132001； 2.广州优迪生物科技股份有限公司，
广东广州510663)
［摘要］目的：研制一种检测B胶联降解产物(B-CTX)和骨钙素N端中分子片段(N-MID)水平的双标记时间分辨免疫荧光分析方法(TRFIA)并评价其检测性能。方法：将抗B-CTX和N-MID 的4E5和2B7单克隆抗体(MAb)作为包被抗体包被在96孔培养板，采用铕离子(Eu3+)和钐离子(Sm3+)分别标记2G6和5A3MAb作为检测抗体，建立双抗体夹心TRFIA分析法并制备成试剂盒。 通过试剂盒的灵敏度、准确度(稀释回收率)、特异性、精密度、稳定性和临床样本比对等实验评价其检测性能。结果：制备的双标记TRFIA试剂盒对B-CTX的检测灵敏度为0.025(ig・L-1，线性范围为0.025〜5.000,ug・L-1，对N-MID的检测灵敏度为0.5,ug・L-】，线性范围为0.5~200.0,ug・L-幕B-CTX平均稀释回收率为102.13%,N-MID平均稀释回收率为103.02%，与其他常见骨检测指标无明显交叉反应，特异性较强。B-CTX批内变异系数(CV)为5.81%~7.82%，批间CV为5.97%~ &02%；N-MID批内CV为6.05%~8.32%，批间CV为6.14%~8.56%；TRFIA试剂盒可在4°C稳定保存6个月，37C稳定保存7d。结论：建立的双标记TRFIA方法具有高灵敏度、高特异度、高准确率和方便快捷等优点，适用于大批量临床样品的检测。
［关键词］B胶联降解产物；N端中分子片段；骨质疏松症；双抗体夹心；双标记时间分辨免疫荧光分析 ［中图分类号］R331［文献标志码］A
Establishment and evaluation of a double-labeled time-
resolved immunofluorescence analysis method for detecting
levels of B-CTX and N-MID
MAO Qian1,CHEN Cuicui2,LIANG Huankun2,LIU Penge2,ZHONG Shuhai2,LI Laiqing2
(1.Department of Endocrinology，Affiliated Hospital，Beihua University，Jilin132001，China；
2.Guangzhou Youdi Biotechnology Co.，Ltd.，Guangzhou510663，China)
ABSTRACT Objective：To develop a double-labeled time-resolved immunofluorescence analysis (TRFIA)method for the determination of the levels of B-cross-linked C-terminal telopeptide of type I collagen(B-CTX)and N-terminal middle molecular fragment of osteocalein(N-MID)of osteocalcin, and to evaluate its detection performance.Methods:The4E5和2B7monoclonal antibodies(MAb)of B-CTX and N-MID antigens were constructed，and then coated as coating antibodies in96-well plates，and
［收稿日期］2020-07-14
［基金项目］吉林省卫计委卫生技术创新项目(2017J076)
［作者简介］毛骞(1977—)，女，吉林省吉林市人，副主任医师，医学硕士，主要从事内分泌基础和临床方面的研究［通信作者］李来庆，工程师(E-mail：********************)
毛骞，等.检测P-CTX和N-MID的双标记时间分辨免疫荧光分析方法的建立和评价771
the antibodies were labeled with europium ion(Eu3+)and samarium ion(Sm3+),respectively.A double antibody sandwich TRFIA method was established and prepared into a kit.The detection performance was evaluated by the sensitivity，accuracy(dilution recovery)，specificity，precision，stability，and clinical sample alignment of the kit.Results:The prepared double-labeled TRFIA Kit had a detection sensitivity of 0.025^g
*L-1for B-CTX and a linear range of0.025—5.000^g*L-1；the detection sensitivity for N-MID was0.5^g
*L—1,and the linear range was0.5—200.0^g•L—1；the average dilution recovery rate of B-CTX was102.13%,and the average dilution recovery rate of N-MID was103.02%；there were no obvious cross-reaction with other common bone test indicators and the specificity was high.The intra-assay coefficient of variation(CV)of B-CTX was 5.81%—7.82%,and the inter-assay CV was 5.97%—8.02%；the intra-assay CV of N-MID was 6.05%—8.32%，and the inter-assay CV was 6.14%—8.
56%；the TRFIA Kit could be stored stably at4°C for half a year and stably stored at37°C for7d. Conclusion:The established B-CTX and N-MID double-labeled TRFIA method has the advantages of high sensitivity，high specificity，high accuracy，convenience and speed，and is suitable for the detection of large-scale clinical samples.
KEYWORDS B-cross-linked C-terminal telopeptide of type I collagen；N-terminal middle molecular
fragment of osteocalein；osteoporosis；double immunofluorescence analysis
近年来，骨质疏松症发病率不断升高，严重威胁人们的健康和生命安全［1］o骨质疏松症早期常不能引起人们的注意和重视，就诊时病情严重甚至已发生骨折。目前主要采用双能X线吸收仪（dual energy X-ray absorptiometry，DXA）测定骨密度来诊断骨质疏松症，但存在价格昂贵、操作繁琐和普及率低等不足，在基层难以推广应用［2-3］。因此，早期快速、准确、敏感和定量诊断对预防和监测骨质疏松症具有重要意义。B胶联降解产物又称I型胶原羧基端肽B特殊序列（B-cross-linked C-terminal telopeptide of type I collagen,B-CTX），是骨重建过程中胶原被降解后释放入血的片段，B-CTX水平的升高反映了骨吸收程度、骨质流失增加，以致骨质疏松症和变形性骨病的发生。B-CTX与骨转换或骨矿物质密度（bone mineral density,BMD）等标志物之间存在相关性，是诊断骨转移的潜在标志物［"。骨钙素可直接反映骨形成的状况，但血液标本放在室温下1h后，骨钙素即会大量降解，
其降解产物骨钙素N端中分子片段（N-terminal middle molecular fragment of osteocalein,N-MID）因其具有良好的稳定性和重复性，可代替骨钙素反映骨形成状态［］。因此，N-MID常应用于骨质疏松症的临床疗效观察和预后判断⑺切。本研究在国内首次建立了B-CTX和N-MID水平双标记的时间分辨免疫荧光分析（double-labeled time-resolved immunofluorescence antibody sandwich；double-labeled time-resolved
analysis,TRFIA）法，以ELISA检测结果作为金标准进行对比，为快速、精准筛查或监测骨质疏松症提供了新的技术手段。 1材料与方法
1.1抗体、试剂和仪器信号调理模块
抗B-CTX和N-MID单克隆抗体（MAb）4E5和2B7（包被抗体）、2G6和5A3（检测抗体）和B-CTX和N-MID标准抗原均由广州优迪生物科技股份有限公司制备，铕离子（Eu3+）和钐离子（Sm3+）标记试剂盒（美国PerkinElmer公司），牛血清白蛋白（美国Fitzgerald公司），Sephades-G50填料（美国GE公司），96孔培养板（美国Costar 公司），包被缓冲液、洗涤液、封闭液和增强液均为自制。Victor1420全自动时间分辨荧光免疫分析检测仪（美国PerkinElmer公司）。
1.2固相包被抗体的制备和检测抗体的标记
将构建好的包被抗体采用缓冲液稀释至10mg-L-1，按每孔100“L加入96孔微孔板中包被，4C过夜，弃去包被液，加入封闭液，每孔250^L,37C封闭2h，弃掉封闭液，洗涤液洗涤2次，真空冷冻抽干，于一20C保存备用。按照试剂盒说明书，采用Eu3+和Sm3+标记试剂盒进行抗体标记。
1.3标准品的制备
采用Tris-HCl缓冲液（pH7.8），将B-CTX抗原配制成浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5和
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5.0“g・L-1的系列标准品溶液，将N-MID抗原配制成浓度为0、10、20、80、160和200“g・L-1的系列标准品溶液°
1.4TRFIA方法检测性能评估
车载mp3驱动1.4.1灵敏度和特异度检测采用“1.3”步骤中制备的B-CTX系列标准品绘制标准曲线，以0^g-L-1B-CTX标准品为样本，将其测定的20次荧光值均值（mean）加上2倍的标准差（2SD）代入标准曲线方程，计算TRFIA方法的灵敏度。采用“1.3”步骤中制备的N-MID系列标准品绘制标准曲线，绘制方法同B-CTX标准品。
特异度检测：同时检测B-CTX标准品、N-MID标准品、I型胶原蛋白氨基末端肽（N-terminal peptide of collagen type I,NTX）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resisitant acid phosphatase, TRACP）、生长激素（growth hormone,GH）、骨特异性碱性磷酸酶（bone specific alkaline phosphatase, BACP）、骨保护蛋白（osteoprotegerin,OPG）和甲状旁腺素（parathyroid hormone,PTH）水平。1.4.2准确度和精密度实验对浓度已知的3个B-CTX和N-MID标准品分别按1:2、1:4和1：8浓度倍比稀释，每个样本重复检测3次，比较样本的测定值、真值并计算其比值（稀释回收率）°将B-CTX和N-MID标准品分别稀释至高、中和低3个浓度，每个浓度各设3个复孔，重复检测10次，对测定结果进行分析。
1.4.3稳定性实验采用本研究制备的TRFIA试剂盒置于4°C冰箱6个月和37°C、7d，对试剂盒的物理外观，剂量-反应曲线的线性、灵敏度、准确度和特异度等指标进行测定，具体检测方法同T.4.1”和“1.4.2”步骤。
1.5临床样本对比检测
收集2018年3月一2019年3月北华大学附属医院X射线骨密度仪确诊的骨质疏松症患者晨起空腹血清和对应健康成人的晨起空腹血清。骨质疏松症患者分为青少年组（15例）、妊娠期妇女组（22例）、绝经期妇女组（26例）和老年人组（31例），阴性样本为对应年龄段的非骨质疏松的健康者。B-CTX和
N-MID分别采用TRFIA法、化学发光法和ELISA法进行比对试验，分析评价其对骨质疏松症的检测效果°
1.6统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。平行测定10次0”g・L-1参考标准品的荧光值，计算其标准差，并代入标准曲线计算灵敏度，采用Graph Pad Prism5统计软件计算标准曲线方程，采用Origin8软件绘图°
2结果
2.1TRFIA的最佳反应条件
经过优化，最终确定TRFIA最佳的反应条件：B-CTX和N-MID包被抗体的浓度为10mg-L-1，每孔100吐和8mg-L—1，每孔100“L；Eu3+标记试剂：标记抗体最佳比例为70“L：30“L；Sm3+标记试剂：标记抗体最佳比例为75“L：25“L；反应体系为25“L标准品或待测样品+200“L分析缓冲液+每孔200“LEu3+（或Sm3+）-检测抗体+每孔200“L增强液。
2.2灵敏度和特异度实验结果
B-CTX方程：Y=0.9988X+0.8576,R2= 0.9994，线性范围为0.025〜5.000“g・L- 1；N-MID方程：Y=0.0330X+0.6211,R2= 0.9994，线性范围为0.5〜200.0^g-L-1°平行测定10次0“g・L-1参考标准品的荧光值，并计算其均值（mean）及标准差（SD），采用mean+2SD 代入标准曲线方程，计算出TRFIA法对B-CTX的检测灵敏度为0.025^g-L—1,TRFIA法对N-MID 的检测灵敏度为0.5^g-L-1°同步检测NTX、TRACP、GH、BALP、OPG和PTH均为阴性，无明显交叉反应表明该试剂盒特异性良好。绘制的标准曲线见图1°
2.3准确度和精密度实验结果
B-CTX的3个样品3个水平稀释度的稀释回收率为98.6%〜104.6%,N-MID的3个样品3个水平稀释度的稀释回收率为98.9%〜105.6%（表1），稀释倍数与浓度呈线性关系。批内变异系数（CV）为5.81%〜7.82%,B-CTX批间CV为 5.97%〜8.02%；N-MID批内CV为6.05%〜8.32%，批间CV为6.14%〜8.56%（表2）°批内和批间CV均小于10%，符合临床检测试剂盒要求。
2.4稳定性实验结果
试剂盒置于4C冰箱能稳定保存6个月以上，37C热破坏性试验能稳定保存7d以上，说明该TRFIA方法制备的试剂盒稳定性较好°见表3°2.5临床样本的对比检测结果
将制备的双标记检测试剂盒与CLIA和ELISA 法同时检测94例骨质疏松症患者和94例非骨质疏
毛骞，等•检测B-CTX和N-MID的双标记时间分辨免疫荧光分析方法的建立和评价773
A：Standard curve of B"CTX.B:Standard curve of N-MID.
图1TRFIA试剂盒的标准曲线
Fig.1Standard curves of TRFIA Kit
表1TRFIA试剂盒的稀释回收率
Tab.1Dilution recovery rates of TRFIA Kit
Sample Dilution Concentration[p/yg・L—1)]Determined[p〃/(卩g・L—1)]Recovery rate(^/%) B-CTX standard11：28.48.53101.6
1：4 4.2 4.34103.3
1：8 2.1 2.18103.8
B-CTX standard21：29.69.4798.6
1：4 4.8 4.92102.6
1：8 2.4 2.51104.6
B-CTX standard31：210.410.69102.8
1：4 5.2 5.27101.3
1：8 2.6 2.62100.6
N-MID standard11：2110.4110.1899.8
1：455.257.79104.7
1：827.629.06105.3
高精度室内定位N-MID standard21：2164.8162.9998.9
1：482.485.53103.8
发泡工艺1：841.242.89104.1
N-MID standard31：2180.8180.2699.7
1：490.495.19105.3
1：845.247.73105.6
松症健康者的血清，TRFIA法与CLIA和ELISA法检测结果一致，3种检测方法的符合率为100%（表4），表明本研究建立的TRFIA方法可快速、准确和定量地检测B-CTX和N-MID临床样本。
3讨论
TRFIA是一种理想的免疫测定方法，已广泛应用于各个领域，如临床研究、分子生物学、药物分析和病毒的检测"12］。采用镧系元素螯合物时，由于发射波长和动力学不同，非特异性背景和特异性信号的时间分辨荧光有区别，因而能够采用Eu3+和Sm3+螯合物开发双标签TRFIA，从而可以同时检测2种分子［13-15］。
骨质疏松相关的骨折风险通常通过BMD评估，但是由于骨强度也由其他因素决定，如骨几何形状、微结构和大小，因此BMD本身并不是骨折风险的良好预测指标［1""。目前，
骨转换的生化标
774吉林大学学报（医学版）第47卷第3期2021年5月
表2TRFIA试剂盒检测的精密度
Tab.2Precision of TRFIA Kit detection
Item
Sample Average
Standard deviation CV(n/%) Test Concentration0/(卩g・L j)]
B-CTX Intra-assay Low0.250.027.82
Median 1.800.12 6.47
High 3.700.21 5.81 Inter-assay Low0.300.037.56
药草香
Median 2.300.14 5.98
High 3.900.26 6.75
N-MID Intra-assay Low 2.500.218.32
断头锁Median55.60 3.36 6.05
High113.408.417.42 Inter-assay Low 3.800.308.02
Median66.50 4.08 6.14
High124.309.487.63
表3TRFIA试剂盒检测的稳定性
Tab.3Stabilities of TRFIA Kit detection
Group B-CTX(4C)N-MID(4C)
(month)01236(month)01236 Sample10.230.230.210.190.1720.2320.1020.0620.0119.32 Sample20.500.490.480.490.4940.6840.6740.5140.3039.98 Sample3 1.68 1.60 1.53 1.58 1.4780.7480.7079.9179.1278.93 Sample4 4.87 3.35 3.24 3.30 3.28126.30126.02125.61125.30124.01 Sample5 4.87 4.80 4.82 4.75 4.69186.50186.00185.30185.90184.24 G r ou p B-CTX( 37C)N-MID(37C)
(t/d)01357(t/d)01357 Sample10.250.250.240.250.2422.6022.6022.5022.5222.46 Sample20.480.480.480.480.4750.4050.6049.6049.0148.53 Sample3 2.06 1.95 1.87 1.90 1.8280.7280.6379.8179.2178.64 Sample4 3.54 3.50 3.51 3.45 3.38110.96110.52109.60109.10108.73 Sample5 4.93 4.90 4.85 4.80 4.75160.48160.10159.72158.14158.23
志物正被用于预测骨质流失的速度和评估老年人骨折的风险。可以通过确定代表骨重塑过程的某些蛋白质的血清或尿液浓度来估计骨转换率［18］。这些蛋白质可以分为骨形成标记和骨吸收标记，最具特异性和最敏感的骨形成标记物包括B-CTX和N-MID"21］。
本研究拟采用Eu3+标记抗B-CTX单克隆抗体和Sm3+标记抗N-MID单克隆抗体，采用双抗体夹心法建立B-CTX/N-MID双标记TRFIA试剂，自行研制能同时检测人血液B-CTX和N-MID的TRFIA试剂盒，本研究所研制的试剂盒检测结果显示：B-CTX的检测灵敏度为0.025^g-L-1、N-MID的检测灵敏度为0.5^g-L—1，定量线性范围B-CTX在0.05〜5.00“g・L-1、N-MID的线性范围为0.5〜200.0”g・L-1，检测范围宽。B-CTX平均稀释回收率为102.13%,N-MID平均稀释回收率为103.02%，与其他常见骨检测指标无明显交叉反应，特异性较强；B-CTX批内CV为5.81%-7.82%，批间CV为5.97%〜8.02%；N-MID批内CV为 6.05%〜8.32%，批间CV为 6.14%〜&56%，达到临床测试要求（批内CV<10%，批间CV<15%）o此外，双标记试剂盒可在4C稳定保存6个月，37C稳定保存7d，这使该双标记TRFIA成为本方法的良好替代品。
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