高俊平(山东省潍坊科技学院贾思勰农学院潍坊262700)
摘要基因组步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。本文介绍了近年来出现的几种主流基因组步移技术，以期为相关研究提供方法借鉴。 关键词基因组步移基因组酶切连接PCＲ
基因组步移(genomic walking)是指从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针，从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆含有与探针相重叠的序列。从第二个重组克隆再分离出末端小片段作为探针筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段。它是一种重要的分子生物学研究技术，可以有效克隆已知片段侧翼的未知序列。
迄今为止，基因组步移主要有两种方法：一是结合基因组文库的基因组步移技术，此方法适于长距离步移，可以获得某一特定染体较长连续区段的重叠基因组克隆；另一个是以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCＲ)扩增为主要手段的基因组步移技术，该方法产生的步移距离相对较短，但是操作简单，尤其适合于寻求已知片段旁侧的未知序列。1基于基因组文库的基因组步移技术
基因组文库是指生物体的全部DNA经过合适的核酸内切酶消化或机械切割以后，克隆到合适的载体分子
中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，就包含了这个生物体的整个基因组信息，也就成为了此生物体的基因组文库。它是基因组学研究的重要技术平台，目前构建基因组文库的方法主要有两种：物理剪切法和限制性内切酶法［1］。
抗振压力表以基因组文库为基础进行基因组步移的步骤大体如下:①用与目的基因连锁的分子标记为探针筛选整个基因组文库，鉴定出分子标记所在的大片段克隆;
②再以该克隆为基因组步移的起点，用外侧克隆末端作为探针筛选基因组文库，分离新的重叠克隆(阳性克隆);③多次重复上述步骤，逐渐逼近目的基因，构建目的基因区域的重叠;④通过亚克隆文库获得含有目的基因的小片段克隆，并对其进行遗传转化和功能互补验证，从而最终确定目的基因的核酸序列。
2基于PCＲ技术的基因组步移技术
随着PCＲ技术的发明，以该技术为基础发展了多种基因组步移方法，这些方法按原理可分为两类：一是依赖酶切连接介导的PCＲ法；二是不需要酶切连接的PCＲ法。
2．1依赖酶切连接的PCＲ此类方法首先对基因组DNA进行酶切，然后把酶切产物连接成环或在酶切产物末端加上相应的接头。根据已知序列设计的特异引物和接头上的锚定引物分别作为PCＲ反应的正
反向引物，以此来扩增已知序列的上下游侧翼序列。2．1．1反向PCＲ反向PCＲ(inverse PCＲ，IPCＲ)的原理是对已知序列进行限制性内切酶位点分析，然后选取已知序列中没有位点的限制性内切酶，对基因组DNA进行酶切并将酶切片段环化自连，然后根据已知序列设计反向引物，扩增已知序列两侧的未知序列。IPCＲ的优点是操作简单；缺点是环化过程难以控制，这是因为酶切位点随机分布，有可能产生较长的片段，从而导致PCＲ扩增效率下降。鉴于此，科研人员在此基础上发展了桥连IPCＲ：环化的过程中，在酶切位点之间特意加上一段桥连片段，从而能更有效地扩增侧翼片段。Chen等［2］通过IPCＲ技术克隆了小麦花粉特异性基因TaPSG719的启动子序列。尽管IPCＲ应用不多，但它开创了利用PCＲ技术进行基因组步移的先河。以此为基础，大量应用PCＲ技术进行基因组步移的方法相继涌现。
2．1．2载体PCＲ载体PCＲ(single specific primer PCＲ，SSP-PCＲ)是指把基因组DNA酶切片段连接到质粒载体上，并用已知序列设计的特异引物和载体上的通用引物特异扩增目标片段的一种PCＲ技术。SSP-PCＲ实验设计简单，尤其适合于保存有cDNA或基因组文库的实验室，但是其操作较繁琐，特异性较低，产物仍需做进一步的鉴定。Gowik等［3］运用SSP-PCＲ技术成功克隆出了一种黄顶菊基因(ppcA1)的启动子序列。2．1．3连接单链接头的PCＲ单链接头PCＲ(panhandle PCＲ，P-PCＲ)是连接单链接头PCＲ的典型代表，因其关键环节形成一个锅柄状结构，故也称锅柄PCＲ。其原理为：基因组DNA先用限制性内切酶酶切，然后在酶切片段末端连接上含有自由端的单链寡核苷酸链(3'
端与已知序列中部分片段完全反向互补)，这样含有连接片段的单链DNA在合适的温度下会自身退火形成一个类似锅柄结构的环，接下来用在已知序列内呈线性排列的3个单引物进行3次PCＲ扩增，即得到目的片段。P-PCＲ的优点是特异性较高，但由于单接头连接效率低，会限制锅柄结构的形成。在此基础上，科研人员对其进行了改进，即在形成锅柄之前在3'末
端连接双脱氧胞苷三磷酸(ddCTP)，从而使引物错配的概率减少，特异性则相对增加。Shang等［4］运用改良的P-PCＲ技术从灵芝中成功克隆出了羊毛固醇合酶基因的启动子序列。
2．1．4连接双链接头的PCＲ双链接头PCＲ法主要原理为：用能够产生黏性末端的限制性内切酶切割基因组DNA，将酶切好的DNA片段和退火双链接头用T4连接酶连接起来，最后通过一条特异性引物和一条根据接头序列设计的引物进行PCＲ扩增(有时需要进行巢式PCＲ)，即可获得包含有侧翼序列的片段。在实际运用过程中，科研人员根据具体情况发展出捕捉PCＲ(capture PCＲ)、抑制PCＲ(suppression PCＲ)、T接头连接的PCＲ(T-linker-specific ligation PCＲ，T-linker PCＲ)等多种步移方式。双链接头的PCＲ的优点是特异较好，但由于要进行基因组酶切，所以对基因组DNA的质量要求较高，而且步骤较为繁琐。笔者曾运用双链接头的PCＲ成功克隆了日本沼虾胰岛素样促雄性腺激素基因和胰岛素样促雄性腺激素结合蛋白基因的全基因组序列(含启动子区域和内含子区域)［5］。2．2非依赖酶切连接的PCＲ酶切介导的PCＲ步移技术无疑都会受到酶切位点的限制，因此研究者开发了非依赖酶切连接的PCＲ技术，主要有以下几种: 2．2．1新Alu-PCＲAlu因子是一类仅存在于灵长类基因组
中的短片段重复序列，平均大约每4kb碱基就出现一次。研究者利用这一规律，发明了Alu-PCＲ。其原理是根据Alu的序列设计引物，来扩增两个Alu 之间的片段区域。新Alu-PCＲ则是根据已知序列或是外源插入序列与Alu保守序列设计引物，扩增所需的未知侧翼序列。因Alu仅存在于灵长类，这也大大限制了Alu-PCＲ在其他物种的应用。
2．2．2热不对称交错PCＲ热不对称交错PCＲ(thermal asymmetric interlaced PCＲ，TAIL-PCＲ)是非酶连介导的PCＲ基因组步移技术的典型代表。其基本原理是根据已知序列区域设计三个具有高退火温度、较长的巢式特异引物，将它们分别和一个具有低退火温度、较短的(16nt)任意简并引物(arbitrary degenerate primer，AD)配合使用，根据引物的长短和特异性差异设计不对称循环温度，并通过三级PCＲ反应得到目的产物。TAIL-PCＲ技术简单方便，反应高效灵敏，产物特异性高，多数情况下能够获得较为满意的结果，因而应用非常广泛，几乎适用于所有物种的基因组。例如，Song等［6］运用此方法从沙冬青中成功分离克隆了肌醇半乳糖苷合酶基因的启动子序列。但不容忽视的是，TAIL-PCＲ也存在AD引物结合位点有限导致扩增产物较短(一般情况小于1kb)以及整体所需引物组合较多、反应条件设置要求比较精细等问题。鉴于此，科研人员对其进行了改进并建立了高效热不对称交错PCＲ技术(hiTAIL-PCＲ)。改进之处在于：简并引物序列适当增长(LAD)为33 34nt，而不是原来的16nt，且LAD引物的5'端为用于第二轮PCＲ的基因特异引物SP2序列，这样就保证了扩增的特异性。因此，hiTAIL-PCＲ比TAIL-PCＲ扩增成功率更高，产物也更长(可达3kb)［7］。2．2．3引物退
火控制PCＲ引物退火控制(DNA walking annealing control primer，DW-ACP)PCＲ策略的核心在于采用了复性控制引物(annealing control primer，ACP)。ACP有3部分组成，依次为:3'端的目标核心序列、中间的调节序列和5'端的非目标尾部序列。目标核心序列能和待扩增区域的某一部位特异结合，但位置随机；非目标尾部序列主要起到调节整条引物Tm的作用；调节序列是其中关键部分，它能促进目标核心序列与模板特异性结合而抑制非目标尾部序列与模板的非特异性结合，从而阻碍非特异性扩增。该方法程序较为简单，扩增特异性高，不足之处在于: ACP引物受专利保护，3'端的目标核心序列尚未公开。Harreither等［8］运用此方法从真菌中分离了纤维二糖脱氢酶基因组全长序列。
3总结与展望
虽然测序技术飞速发展，但当前某一物种的全基因组测序价格仍然异常昂贵，因此，基因组步移仍旧是获取基因组DNA序列的首选途径。以上介绍的几种技术是典型的基因组步移方法，每种方法都有其优点和局限性。根据笔者的经验，在具体的实验实际操作中，可以通过几种方式联合起来进行基因组步移，从而有效地获取目的基因。同时，随着分子生物学和基因工程技术的发展，更高效基因组步移方法的出现指日可待。
主要参考文献
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易琴谢建平*(西南大学生命科学学院现代生物医药研究所重庆400715)
摘要模式微生物结构简单、繁殖迅速，是研究人类基因组等遗传学问题的重要材料。本文探讨利用主要模式微生物培养学生的生命观念，实现发展学生生物学核心素养的课程目标。
关键词模式微生物生命观念中学生物学核心概念探究实验
《普通高中生物学课程标准(2017年版)》提出：学生应该在较好地理解生物学概念的基础上形成生命观念，如结构与功能观、进化与适应观、稳态与平衡观、物质与能量观等。利用模式生物，尤其是模式微生物作为工具进行高中生物学教学，有助于融抽象的概念教学于生动、具体的情境中，实现以核心素养为主的高中生物学课程目标，有效培养学生的生命观念。鱼算法
1模式微生物的相关概念
模式生物(model organisms)是研究中采用较多，有助于理解生命科学一般规律的生物。它具备以下特点:①其生理特征能够代表生物界的某一大类;②容易获得，并易于在实验室内饲养、繁殖;③容易进行实验操作，特别是遗传学分析;④研究体大，同一种模式生物的研究者之间共享观点、实验方法、实验系统和生物品系，从而促进研究的快速发展［1］。研究模式生物的生命现象，从而揭示其生长规律，有利于学生理解生命的普遍规律［2］。
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普通高中生物学教材中随处可见模式生物，其目的不仅是让学生认识模式生物的重要特征并拓展到一般生物，更让学生对科学探究过程有感性认识，把握相关核心概念，从而为进入高等学校继续学习生物学打好基础。
接种棒微生物在地球生态系统的维持与稳定中起着无可比拟的作用。模式微生物在生命科学重大基础理论建立中具有里程碑性意义。例如，Lederberg利用大肠杆菌发现了细菌的基因重组和遗传物质结构，获1958年的诺贝尔生理学或医学奖。1952年，Hershey和Chase 两人利用噬菌体证明了DNA的遗传功能，为最终确立DNA是主要的遗传物质奠定了基础。1958年，我国第一位细菌学博士余贺教授筛选特异性噬菌体成功控制了大面积烧伤工人邱财康的铜绿假单胞菌感染。
教材中常见的模式微生物包括：酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和噬菌体。
2如何运用模式微生物培养学生的生命观念
2．1以模式微生物为纽带建立相关核心概念间的联系生物学知识不是相互独立而是密切联系的。在教学过程中，合理引导学生发现概念与概念间的联系，准线索，最后织出一张牢固的核心概念网，逐步形成生命观念。
破碎机锤头铸造工艺例如，噬菌体侵染细菌经典实验最终证明了DNA 是遗传物质，而基因的本质是具有遗传效应的DNA片段，基因的表达是通过DNA控制蛋白质的合成来实现的，基因突变是DNA分子中碱基对发生替换、增添和缺失引起的基因结构的改变。基因突变产生新基因，进化原始物种，通过自然选择形成新物种。生态系统是由生物落与它的无机环境相互作用而形成的统一整体，生态系统中生产者是生态系统的基石，消费者可加快物质循环，分解者是必不可缺的重要成分。因此，仅主要模式微生物(噬菌体、大肠杆菌、酵母菌)就涉及到了基因、进化、种和生态四种重要概念(图1)，教师若能引导学生从模式微生物发散开来掌握核心概念，既能鼓励学生自己建立概念间的联系，又能引发学生对已有知识的联想和获得新知识的渴望，突出核心概念的地位与作用，实现了以学生为主体的教与学。
2．2基于模式微生物开展探究实验在实验中利用模式生物为材料有很大的优点：一方面，学生可以掌握模式生物的生长习性和实验室培养方法；另一方面，模式生物往往有丰富的突变体等材料可以用于实验，相比非模式生物可以取得更好的效果；此外，模式生物往往便于实验室培养和操作，利于我们将传统的验证性实验改为探究性实验。
对于高中生来说，理解抽象的生物学概念是一道
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