凝胶⾊谱分析⼆〇⼀⼀年九⽉九⽇
第九章凝胶⾊谱分析
凝胶渗透⾊谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），⼜称尺⼨排阻⾊谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）⽽实现物质的分离。GPC可⽤于⼩分⼦物质和化学性质相同⽽分⼦体积不同的⾼分⼦同系物等的分离和鉴定。凝胶渗透⾊谱是测定⾼分⼦材料分⼦量及其分布的最常⽤、快速和有效的⽅法[1]。凝胶渗透⾊谱（GPC）的创⽴历程如下[2,5]： 1953年Wheaton和Bauman⽤多孔离⼦交换树脂按分⼦量⼤⼩分离了苷、多元醇和其它⾮离⼦物质，观察到分⼦尺⼨排除现象；1959年Porath和Flodin⽤葡聚糖交联制成凝胶来分离⽔溶液中不同分⼦量的样品；1964年J. C. Moore将⾼交联密度聚苯⼄烯-⼆⼄烯基苯树脂⽤作柱填料，以连续式⾼灵敏度的⽰差折光仪，并以体积计量⽅式作图，制成了快速且⾃动化的⾼聚物分⼦量及分⼦量分布的测定仪，从⽽创⽴了液相⾊谱中的凝胶渗透⾊谱。 近年来，光散射技术（如图9-1所⽰，⼀束光通过⼀间充满烟雾的房间，会产⽣光散射现象。）⼴泛应⽤
视频门禁系统于⾼分⼦特征分析领域[3]。将光散射技术和凝胶渗透⾊谱（GPC）分离技术相结合，可以测定⼤分⼦绝对分⼦量、分⼦旋转半径、第⼆维⾥系数，也可测定分⼦量分布、分⼦形状、分枝率和聚集态等。⽬前，该技术在⾼分⼦分析领域已成为⼀种⾮常有效的⼯具，在美国，⽇本及欧洲⼴为使⽤，国内近年来亦引进了此项技术。
⼊射光
散射光
图9-1光散射现象
9.1 基本原理
9.1.1凝胶渗透⾊谱分离原理
让被测量的⾼聚物溶液通过⼀根内装不同孔径的⾊谱柱，柱中可供分⼦通⾏的路径包括粒⼦间的间隙（较⼤）和粒⼦内的通孔（较⼩）。如图9-2、图9-3所⽰，当待测聚合物溶液流经⾊谱柱时，较⼤的分⼦只能从粒⼦间的间隙通过，被排除在粒⼦的⼩孔之外，速率较快；较⼩的分⼦能够进⼊粒⼦中的⼩孔，通过的速率慢得多。这样经过⼀定长度的⾊谱柱分离后，不同相对分⼦质量的物质就被区分开了，相对分⼦质量⼤的在前⾯流出（其淋洗时间短），相对分⼦质量⼩的在后⾯流出（淋洗时间长）。 从试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分
⼦量有关，分⼦量愈⼤，其淋出体积愈⼩[7]。
图9-2 不同尺⼨分⼦通过凝胶原理图
显然，凝胶⾊谱法的分离是严格地建⽴在分⼦尺⼨基础之上的，通常不应该在固定相上发⽣对试样的吸着和吸附。同时，也不应该在固定相和试样之间发⽣化学反应（当然，也有⼀些凝胶⾊谱填料，例
如，表⾯磺化交联聚苯⼄烯颗粒，主要是基于分⼦尺⼨⼤⼩⽽进⾏分离的。但其表⾯磺化层⼜与被测离⼦之间有轻微的离⼦交换作⽤）。
图9-3 凝胶渗透⾊谱分离不同分⼦尺⼨试样⽰意图
凝胶渗透⾊谱法的特点是样品的保留体积不会超过⾊谱柱中溶剂的总量，因⽽保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔⼀定时间连续进样⽽不会造成⾊谱峰的重叠，提⾼了仪器的使⽤效率。其缺点则是柱容量较⼩。
通常洗脱剂分⼦是⾮常⼩的，它们的谱峰⼀般是在⾊谱图中最后出现（此时为0t
）。显然，各被测物质均在0t 之前被洗脱，即它们的R t 均⼩于0t
，这与液-液、液-固和离⼦交换⾊
谱的情况正好相反。
9.1.2 ⾊谱柱参数及其测定⽅法[6]
（1）柱参数。将凝胶⾊谱柱填充剂的凝胶颗粒⽤洗脱剂溶胀，然后与洗脱剂⼀起填⼊柱中，
此时，凝胶床层的总体积为t V
g i t V V V V ++=0 （9-1）式（9.1）中，0V 为柱中凝胶颗粒外部溶剂体积；i V 为柱中凝胶颗粒内部吸⼊溶剂的体积；g
V 为凝胶颗粒⾻架的体积。
t V 、0V 、i V 和g V 均称柱参数。在实验中，其数值均可以测定。
被测物质的洗脱体积
i 0e KV V V += （9-2）式（9.2）中，K 为固定相和流动相之间的被测溶质的分配系数 i
e i
p V V V V V K 0
—=
=
（9-3）式（9.3）中，p V 为凝胶颗粒内部溶质能进⼊部分的体积。
由上可见，凝胶⾊谱分离的过程中，没有受到任何其它吸附现象或化学反应的影响，它完全基于分⼦筛效应。
①若K=0，待测分⼦不能进⼊凝胶颗粒内部；
②若01，表⾯存在吸附作⽤等其它影响存在。
若将i V ⽤凝胶相的总体积x V 代替，且
g i x V V V += （9-4）则有
)V -(V 000e t a x a V K V V K V +=+= （9-5） 0
t 0
e a V -V V -V K =
（9-6）
式（9.6）中，a K 、0V 和e V 都容易测定，所以在实际⼯作中，⼈们喜欢⽤a K 。a K 与K 之间的关系为
g
i i
a V V V K
K += （9-7）
（2）柱参数的测定。t V 为⾊谱柱的内体积。a V 为完全不能浸⼊凝胶颗粒内部的溶质分⼦的洗脱体积。
例如，可以通过聚苯⼄烯等⾼分⼦化合物来测定0V 和e V 。例如，测定⽤氘标记丙酮和⼰烷（GPC ）的e V ，由公式
i 0e KV V V += （9-8）此时，K=1，所以
0-V V V e i = （9-9）即可求得i V 。
此外
r g i S W V ?= （9-10）式中，g W 为⼲燥凝胶的质量，g ；r S 为凝胶内部单位质量保留溶剂的体积，
mL/g 。
9.1.3 凝胶渗透⾊谱法校正原理
⽤相对分⼦质量已知的单分散标准聚合物预先做⼀条淋洗体积（或淋洗时间）与相对分⼦质量对应关系的曲线，该线称为“校正曲线”。然⽽聚合物中⼏乎不到单分散的标准样，所以⼀使⽤窄分布的试样代替。在相同的测试条件下，做⼀系列的GPC 标准谱图，分别对应不同相对分⼦质量样品的保留时间，以lgM 对t 作图，所得曲线即为“校正曲线”。通过校正曲线，就可以从GPC 谱图上计算出各种所需相对分⼦质量与相对分⼦质量分布的信息。聚合物中能够制得标准样的聚合物种类并不多，没有标准样的聚合物就得不到校正曲线，单独使⽤GPC ⽅法也得不到聚合物的相对分⼦质量和相对分⼦质量分布信息。对于这种情况可以利⽤普适原理加以校正[7]。 9.1.4 普适校正原理
由于GPC 对聚合物的分离是基于分⼦流体⼒学体积⽽实现的，即对于具有相同分⼦流
体⼒学体积的聚合物，能在同⼀个保留时间流出，即它们的流体⼒学体积相同。[8]
依照聚合物链的等效流体⼒学球模型，Einstein 的黏度关系式为
[
]
M NV /.52=η（9-11）式中，[]η为特性黏数；M 为相对分⼦质量；V 为聚合物链等效球的流体⼒学体积；N 为阿伏伽德罗常数。可以⽤[]M η来表征聚合物的流体⼒学体积。
两种柔性链的流体⼒学体积相同：
[η]1M 1=[η]2M 2 （9-12）
式中，脚标1和2分别代表两种聚合物，把Mark-Houwink ⽅程
[η]=KM （9-13）
2
1
122111αα++=M k M k （9-14）
两边取对数：
lgk 1+(α1+1)lgM 1=lgk 2+(α2+1)lgM 2 （9-15）
即如果已知标准样和被测⾼聚物的k 、α值，就可以由已知相对分⼦质量的标准样品M 1标定待测样品的相对分⼦质量M 2。
实验证明，该法对线性和⽆规则团形状的⾼分⼦的普适性较好，⽽对长⽀链的⾼分⼦或棒状刚性⾼分⼦的普适性还有待研究。9.1.5 光散射理论
抗氧化植物素
[4,9]
激光照射到样品时，会在各个⽅向产⽣散射光，于是我们可以在⼀个⾓度或多个⾓度收集散射光的强度。
1.光散射所透露的信息
光散射强度与分⼦量和溶液的浓度成正⽐；散射光⾓度的变化与分⼦的尺⼨⼤⼩相关。 1）当分⼦尺⼨⼩于10nm 时，各⾓度散射强度相同；
二维码打印设备
2）当分⼦尺⼨在10与30nm 之间时，散射强度随⾓度增⼤呈现直线下降的趋势； 3）当分⼦尺⼨⼤于30nm 时，散射强度随⾓度增⼤呈曲线下降的趋势。 2.基本理论
通常，溶剂中分⼦光散射现象可⽤公式9-16表达：
c A P M R c K w 2*2)
(1
+=θθ（9-16）式中：
常数 A
N dc dn n K 4
02
2
02*
λ)/(π4= （9-17） n 0是溶剂的折光指数；c 是溶液浓度；N A 是阿伏伽德罗常数；λ0为⼊射光波长；d n /d c 表⽰溶液折射率与浓度变化的⽐值，它表明了聚合物在溶液中的⽐折光指数增量；R θ是超瑞利系数；M w 是重均分⼦量；A 2是第⼆维⾥系数，是溶质与溶剂相互作⽤的量度；P (θ)是光散射强度的函数。
胶囊模具
++=2
θ
sin λ3π161)
(1
2
20
2
2G
r P θ（9-18）将P 代⼊式（1）展开得：
c A r M R c K G w 22222θ*2]2
θ
sin λ3π161[1+++= （9-19）在上式中，R θ为测量值，K *c 、λ0、θ为已知值；M w 、A 2、r g 为未知值。
3.Zimm Plot
如图9-4所⽰，为著名的Zimm 曲线。当θ→ 0，c→ 0，简化为
w
M R c K 1
)0(*= （9-20）
图9-4 Zimm Plot
可通过实验测定M w 值。配制不同浓度梯度的溶液，在不同的⾓度测量其散射光强度，绘制Zimm Plot ，求得M w ，及A 2值。但由于结果仅为单⼀平均值，因此较适⽤于成分单⼀，分布较窄的分⼦，对于分布较宽或有不同族分布的样品，则较难看出全貌。
9.2 基本构成及其⼯作原理
9.2.1 GPC 系统组成
GPC 仪的组成：泵系统、（⾃动）进样系统、凝胶⾊谱柱、检测系统和数据采集与处理系统。
1.泵系统
包括⼀个溶剂储存器、⼀套脱⽓装置和⼀个⾼压泵。它的⼯作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流⼊⾊谱柱。泵的⼯作状况好坏直
接影响着最终数据的准确性。越是精密的仪器，要求泵的⼯作状态越稳定。要求流量的误差应该低于0.01 mL/min 。
2.⾊谱柱
⾊谱柱是GPC 仪分离的核⼼部件，在⼀根不锈钢空⼼细管中加⼊孔径不同的微粒作为填料。每根⾊谱柱都存在⼀定的相对分⼦质量分离范围和渗透极限，因此⾊谱柱存在使⽤上限和下限。⾊谱柱的使⽤上限是当聚合物最⼩的分⼦的尺⼨⽐⾊谱柱中最⼤的凝胶的尺⼨还⼤，这时⾼聚物⽆法进⼊凝胶颗粒孔径，全部从凝胶颗粒外部流过，达不到分离不同相对分
祛斑净⼦质量的⾼聚物的⽬的。并且还会有堵塞凝胶孔的可能，影响⾊谱柱的分离效果，会降低其使⽤寿命。
⾊谱柱的使⽤下限是当聚合物中最⼤尺⼨的分⼦链⽐凝胶孔的最⼩孔径还要⼩，这时也达不到分离不同相对分⼦质量的⽬的。因此，在使⽤凝胶⾊谱仪测定相对分⼦质量时，必须⾸先选择⼀条与聚合物相对分⼦质量范围相配好的⾊谱柱。常⽤⾊谱柱如表9-1所⽰。
3.填料
对填料最基本的要求是填料不能被溶剂溶解。主要有有机凝胶和⽆机凝胶。有机凝胶主要有：交联聚⼄酸⼄烯酯凝胶和交联聚苯⼄烯凝胶。交联聚苯⼄烯凝胶的特点是孔径分布宽，分离范围⼤，适⽤于⾮极性有机溶剂。三个系列柱的凝胶颗粒分别为5 um、10 um和20 um，分别⽤于测定低、中和超⾼分⼦量的⾼分⼦。⽆机凝胶主要有多孔玻璃、多孔氧化铝和改性多孔硅胶。其中改性多孔硅胶较常⽤，其特点是适⽤范围⼴（包括极性和⾮极性溶剂）、尺⼨稳定性好、耐压、易更换溶剂、流动阻⼒⼩，缺点是吸附现象⽐聚苯⼄烯凝胶严重。
4.检测系统
检测器装在凝胶渗透⾊谱柱的出⼝，样品在⾊谱柱中分离以后，随流动相连续地流经检测器，根据流动相中的样品浓度及样品性质可以输出⼀个可供观测的信号，来定量地表⽰被测组分含量的变化，最终得到样品组分分离的⾊谱图和各组分含量的信息。通⽤型检测器：适⽤于所有⾼聚物和有机化合物的检测。主要有⽰差折光仪检测器、紫外吸收检测器、粘度检测器。
5.⽰差折光仪检测器
溶剂的折光指数与被测样品的折光指数有尽可能⼤的区别。
6.紫外吸收检测器
在溶质的特征吸波长附近溶剂没有强烈的吸收。
7.选择型检测器
不锈钢钢锭适⽤于对该检测器有特殊响应的⾼聚物和有机化合物。有紫外、红外、荧光、电导检测器等。
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