农业农村部印发《直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株鉴定及其安全性评价指 南》
为进⼀步规范新饲料和新饲料添加剂安全性评价⼯作，根据《饲料和饲料添加剂管理条例》和《新饲料和新饲料添加剂管理办法》，我部制定了《直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株鉴定及其安全性评价指南》，现予印发，请遵照执⾏。
农业农村部办公厅
2021年11⽉1⽇
直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株
鉴定及其安全性评价指南
1 适⽤范围
1.1 本指南规定了直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株鉴定及其安全性评价的基本原则、基本要求、评价⽅法以及结果判定。
1.2 本指南适⽤于新饲料添加剂评审和已经批准使⽤的饲料添加剂再评价时，对直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株开展的鉴定及其安全性评价，包括发酵制品中与⽣产菌株直接相关的安全性评价。 1.3 本指南仅涵盖直接饲喂微⽣物和发酵制品与⽣产菌株相关的鉴定及其安全性评价，产品的其他安全性评价按照相关规定和指南开展。
1.4 本指南所称微⽣物包括细菌、酵母和丝状真菌。其他如古菌、微藻等微⽣物的相关评价可参照本指南要求，采取个案分析评价。
1.5 本指南适⽤于通过农业转基因⽣物安全评价、获得农业转基因⽣物安全证书的转基因微⽣物⽣产菌株及其发酵制品的相关内容评价。 1.6 饲料或饲料原料发酵⽣产所⽤微⽣物菌株的鉴定及其安全性相关内容评价参照本指南进⾏。
2 术语和定义
以下术语和定义适⽤于本指南。
2.1 直接饲喂微⽣物（Direct-Fed microorganisms）
在饲料中添加或直接饲喂给动物的活的微⽣物饲料添加剂。
2.2 发酵制品（Fermentation products）
微⽣物在受控制条件下，通过⽣命活动⽣产的特定代谢产物经分离、提取、纯化、精制和⼲燥等⼯艺制成的饲料添加剂，如氨基酸、维⽣素、酶制剂等。
2.3 抗微⽣物药物（Antimicrobial）
合成或天然存在的能杀死微⽣物或抑制其在动物或⼈体内⽣长或繁殖的活性物质，在本指南中特指抗菌药物。
注：本指南中抗菌药物包括⽤于⼈体或动物的世界卫⽣组织（WHO）定义的极为重要抗菌药物（CIAs）或⾼度重要抗菌药物（HIAs）。
2.4 获得性耐药（Acquired antimicrobial resistance）
旋转连接在对特定抗菌药物典型敏感的菌种中，由于获取外源基因或基因突变引起某⼀菌株对该抗菌药物产⽣的耐药。
2.5 关注基因（Gene of concern）
已知毒⼒因⼦的编码基因、耐药基因，以及与已知毒性化合物产⽣等有关的基因。
2.6 临界值（Cut-off value）
根据抗菌药物对特定微⽣物类（种或属）的最低抑菌浓度（MIC）分布⽽设定的，⽤于耐药判定的值。
2.7 转基因微⽣物（Genetically modified microorganisms）
利⽤基因⼯程技术改变基因组构成的重组微⽣物。
2.8 危害（Hazard）
饲料中对⼈和动物健康有潜在不良影响的⽣物、化学或物理性因素或条件。
2.9 风险（Risk）
饲料中危害产⽣某种不良健康影响的可能性或严重性。
2.10 产毒能⼒（Toxigenicity）
微⽣物产⽣对⼈和动物有毒作⽤的活性代谢产物的能⼒。
2.11 致病性（Pathogenicity）
微⽣物感染宿主造成健康损害引起疾病的能⼒。
2.12 毒性（Toxicity）
微⽣物有毒代谢产物引起的宿主健康损伤。
3 基本原则
3.1 直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株鉴定及其安全性评价应基于当前的科学认知开展，具体的评价试验应遵循本指南规定的⼀般原则，并结合直接饲喂微⽣物和发酵制品特征属性进⾏⽅案设计和试验实施。 3.2 直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株鉴定及其安全性评价试验应按照国家、⾏业标准或参照国际组织标准检测⽅法、技术规范等进⾏，若⽆相关标准检测⽅法、技术规范则按照⾏业公认的检测⽅法进⾏。
3.3 直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株鉴定及其安全性评价试验（包括检测）应由具备微⽣物相关专业知识和试验技能的专业⼈员在具备相应设施设备的试验场所，按照规范的操作程序进⾏。试验应在有效的质量控制下开展，并且由试验机构指定的负责⼈负责。⽤于新饲料添加剂申报的，微⽣物鉴定及其安全性评价试验应由农业农村部指定的评价试验机构开展。农业农村部尚未指定评价试验机构
的，应由具有相应条件和能⼒的检测评价机构开展。
3.4 直接饲喂微⽣物或发酵制品⽣产中使⽤复合菌株时，应分别针对每个菌株开展相关评价。
3.5 本指南中涉及的⽤于菌株安全性分析、⽐对、评价的相关数据库、药物名单等，应采⽤最新版本。
3.6 鉴于菌株在使⽤过程中可能产⽣变异或衰退，开展安全性评价时应充分考虑菌株鉴定报告及安全性评价相关检测报告的时效性。
4 基本要求
通过形态观察、⽣理⽣化检测和分⼦⽣物学分析等技术⽅法对直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株进⾏鉴定。通过表型试验、分⼦⽣物学试验、全基因组序列（WGS）分析、相关⽂献资料综述等，对微⽣物产毒能⼒和致病性、抗菌药物敏感性、抗菌药物产⽣等特性进⾏评价，对直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株安全性进⾏综合评估。不同微⽣物及⽣产菌株评价基本要求见表1。
表1 菌株鉴定及其安全性评价基本要求
评价内容章节直接饲喂微⽣
物
发酵制品⽣产菌
株
细菌酵母和
二恶英检测丝状真
菌
细菌酵母和丝状真菌
微⽣物鉴定 5.1√√√√产毒能⼒和致病性 5.3√√√√抗菌药物敏感性 5.4√√
抗菌药物产⽣ 5.5√√√√
网带窑
⽣产菌株的遗传修饰 5.6仅适⽤于转基因微⽣
物
仅适⽤于转基因微⽣
物
发酵制品中⽆⽣产菌株活细胞评
价
5.7√√
发酵制品中⽣产菌株DNA 检测 5.8必要时必要时
5 评价⽅法
5.1 微⽣物鉴定
5.1.1 基本信息
明确直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株的来源、属名、种名（包括中⽂学名、拉丁学名等）和菌株名称或编号。细菌的命名应遵循原核⽣物系统学国际委员会（ICSP）的规定，并符合原核⽣物国际命名法规（ICNP）要求。酵母和丝状真菌的命名应符合国际藻类、真菌和植物命名法规（ICN）的要求。
明确菌株的改良史，包括实施的诱变步骤和遗传修饰。转基因⽣产菌株的遗传修饰按照5.6的要求进⾏描述。
5.1.2 鉴定
直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株应明确鉴定⾄少到种或亚种⽔平。若根据最新⽅法和当前知识菌株⽆法明确鉴定⾄已有物种，应进⾏菌株及其近缘种的系统发育分析。
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5.1.2.1 细菌鉴定
综合形态观察、⽣理⽣化检测、分⼦⽣物学分析对细菌进⾏鉴定。
——形态观察：包括菌落颜⾊、形状、边缘、透明度等宏观形态观察，以及菌体⼤⼩、形状、⾰兰⽒染⾊反应、是否有芽胞、芽胞的着⽣位置等微观形态观察。
——⽣理⽣化检测：包括碳源利⽤、氮源利⽤、氧化酶反应、过氧化氢酶反应等关键⽣理⽣化特征检测。
——分⼦⽣物学分析：如16S rDNA序列、持家基因序列或WGS等分析。⽤于新饲料添加剂申报的，应利⽤WGS数据进⾏分析鉴定。
5.1.2.2 酵母菌鉴定
综合形态观察、⽣理⽣化检测、分⼦⽣物学分析对酵母菌进⾏鉴定。
——形态观察：包括菌落质地、颜⾊、边缘等宏观形态观察，以及菌体⼤⼩、形状、是否有真假菌丝、⽣殖⽅式等微观形态观察。
——⽣理⽣化检测：包括碳源利⽤、糖类发酵、氮源利⽤等关键⽣理⽣化特征检测。
——分⼦⽣物学分析：如26S rDNA、ITS rDNA等特征序列或WGS分析。
5.1.2.3 丝状真菌鉴定
综合形态观察、分⼦⽣物学分析对丝状真菌进⾏鉴定。
——形态观察：包括菌落的质地、颜⾊、⽣长速度、⾊素的产⽣等宏观形态观察，以及菌丝的颜⾊、产孢结构的⼤⼩及发⽣⽅式、孢⼦颜⾊、形状、是否具有有性⽣殖结构等微观形态观察。
——分⼦⽣物学分析：如18S rDNA序列、ITS rDNA序列及其他特征基因（如微管蛋⽩基因、钙调蛋⽩基因、翻译延伸因⼦等）序列或WGS分析。
5.2 WGS测序
采⽤⼆代和三代测序技术对直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株进⾏全基因组测序，获得其基因组完成图，测序报告⾄少应包括以下信息：
DNA提取⽅法；测序⽅案和仪器；序列组装⽅法，如⽣物信息学⽅法、从头测序或重测序等；序列质量评价，如平均Phred得分、reads数⽬、覆盖度、N50和K-mer等；WGS的FASTA电⼦⽂件；相对于预期基因组⼤⼩的contigs总长度；基因注释⽅法；对于酵母和丝状真菌，还需提供从相关数据库（如BUSCO数据库）获得的注释质量信息。
5.3 产毒能⼒和致病性
应通过国内外安全性评价资料综述、动物致病性试验和WGS分析对直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株的产毒能⼒和致病性进⾏综合评价，其中丝状真菌还应开展产毒试验。
鉴于屎肠球菌（Enterococcus faecium）和芽胞杆菌（Bacillus spp.）已有成熟的致病性评价⽅法，可分别按附录A和附录B开展评价。
5.3.1 国内外⽂献资料综述
通过国内外⽂献数据检索（具体要求见附录C），收集整理菌株的国内外使⽤历史、安全性评价资料，包括对⼈和靶动物的产毒能⼒和致病性的相关信息；若⽆该评价菌株的上述资料，应收集整理同种内其他菌株或与其相近种属的相关信息。若对菌株进⾏了任何降低毒性和致病性的选育（包括诱变和/或遗传修饰），应予以说明。
5.3.2 动物致病性试验
5.3.2 动物致病性试验
制备直接饲喂微⽣物或发酵制品⽣产菌株的菌悬液，将其作为受试物，通过腹腔注射和经⼝灌胃等途径给予实验动物，评价不同暴露途径下受试物对实验动物的致病性。动物致病性试验按照国家、⾏业标准⽅法开展。
5.3.3 WGS分析
5.3.3.1 细菌
将菌株WGS与最新数据库（包括但不限于VFDB、PAI DB、CGE等）中存储的序列进⾏⽐对，分析菌株遗传物质中是否存在已知毒⼒因⼦的编码基因。分析结果重点关注该种或近缘种中已知毒⼒因⼦（如毒素、⼊侵与粘附因⼦）的完整编码基因。结果⾄少应包括如下信息：基因名称、定位（染⾊体
或质粒）、编码蛋⽩的功能、覆盖度（序列长度覆盖度≥70%）、相似性百分⽐（输⼊序列与数据库中序列的匹配度≥80%）和e值（＜10-5）等。
5.3.3.2 酵母和丝状真菌
若菌株有WGS数据，则通过定向搜索确定菌株是否存在与产毒相关的已知代谢途径。
5.3.4 产毒试验
对于丝状真菌，应在多种基质和条件下（单品种固体、多品种固体复合、不同成分液体组合等）进⾏产毒试验，并按照国家标准检测⽅法或国际组织规定的标准检测⽅法进⾏已知毒性化合物含量检测。
对于发酵制品⽣产菌株，若产毒试验检测到已知毒性化合物，还应通过检测分析证明发酵制品中不含该化合物或该含量下风险⽆需关注。
5.3.5 结果分析
5.3.5.1 动物致病性试验显⽰受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡，或试验期间体重等指标与对照组相⽐有显著性差异时，则判定菌株具有致病性。
5.3.5.2 产毒试验检测到已知毒性化合物时，则判定丝状真菌菌株具有产毒能⼒。
审批流5.3.5.3 动物致病性试验显⽰⽆致病性的微⽣物，但WGS分析存在以下情况的，需结合国内外⽂献资料综述、毒⼒因⼦编码基因或产毒代谢相关基因发挥作⽤的机制、相关基因变为活性基因的可能性等情况进⾏综合判断。对于发酵制品⽣产菌株，还应结合⽣产⼯艺、终产品中⽣产菌株和已知毒性化合物的存在情况等进⾏综合判断。
——WGS分析显⽰存在已知毒⼒因⼦的编码基因（或产毒代谢相关基因）的细菌或酵母；
——产毒试验未检测到已知毒性化合物，但WGS分析显⽰存在产毒代谢相关基因的丝状真菌。
日志存储5.4 抗菌药物敏感性
直接饲喂微⽣物和发酵制品⽣产菌株为细菌的，应开展抗菌药物敏感性评价。通过开展测定抗菌药物MIC值的表型试验和WGS分析，评价菌株是否具有获得性耐药。
5.4.1 表型试验
⾄少对菌株进⾏附录D所列抗菌药物MIC值的测定。对于附录D中未列出的细菌，⾰兰⽒阳性菌应选择附录D中“棒状杆菌和其他⾰兰⽒阳性菌”规定的抗菌药物，⾰兰⽒阴性菌应选择附录D中“肠杆菌科”规定的抗菌药物。
MIC值测定应采⽤琼脂或⾁汤⼆倍梯度稀释法进⾏定量测定，采⽤国际或国内标准⽅法，如EUCAST、CLSI、ISO、WS等标准⽅法。除⾮抗菌药物不适⽤定量⽅法进⾏测定，否则不得采⽤定性或半定量⽅法（如扩散法）间接测定MIC 值。
MIC测定通常应选择药物敏感性试验专⽤培养基，如Muelle-Hinton或IsoSensitest培养基。对于某些特定菌种或菌株，
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