几种罹病植物镰刀菌(Fusarium)种类鉴定FANPN
前言
镰刀菌无性时期在分类上原属于半知菌亚门，根据《菌物词典》2001年第9版现属于无性真菌类，有性时期为子囊菌门。镰刀菌因其在无性阶段产生的大型分生孢子形似镰刀而称之。镰刀菌属是在1809 年Link从锦葵科植物上发现第一株镰刀菌定名为粉红镰刀菌(Fusarium roseum Link)的基础上建立起来的[1]。镰刀菌种类多，迄今已发现44 种和7个变种[2]。它们分布极广，在地球上所能及的地方，几乎都能到它的踪迹。镰刀菌历来是真菌学和植病学的主要研究对象之一。 手机绑定
镰刀菌对农业生产具有重要经济意义，其中的许多种是重要的植物病原菌，往往使农作物遭受重大病害，如麦类赤霉病、棉花枯萎病、水稻恶苗病、玉米青枯病、甘薯蔓割病、瓜类枯萎病等[4]，导致农业生产损失严重，甚至颗粒无收。人类栽培的各种作物如稻、麦、棉、麻、油、茶、果树和蔬菜等，均易受到镰刀菌的侵袭而发生各种病害[4 ~ 7]。许多重要的萎蔫病害曾在世界范围内造成许多毁灭性的植物病害。前苏联曾有报道，当种植的甘蓝为感病品种时，镰刀菌所引起的萎蔫病害可使产量降低50%-95%。在前苏联亚麻种植区亚麻萎蔫病发生也极为普遍，且有病的亚麻种子油是有毒的，会引起人畜中毒。花卉植物如紫苑、石竹等等也遭受萎蔫病的损害[8]，有时危害严重到需要停止栽培的地步。除上述病害外，镰刀菌也是根腐病和各种农作物及其他植物贮存期间腐烂病的重要病原，被污染的食品和饲料含有毒质，常使人类和家畜中毒[12]。此外，镰刀菌可引起动物病害，如镰刀菌产生的有毒代谢产物—镰刀菌毒素（Fusariotoxin）毒性很强，污染人类食品和禽畜的饲料，会造成雏鸡、鸭、鹅、鸽子、黄牛、水牛、猪、羊、马、驴等禽畜镰刀菌毒素中毒，是常见的病害。
阿维菌素油膏镰刀菌作为病原微生物也能侵入人体，引起人类的真菌病。如茄病镰孢等镰刀菌可引致人足部溃疡、眼角膜溃疡和大骨节病等。镰刀菌产生的毒素物质可引起人和动物的急性或非急性中毒，甚至死亡。据报道串珠镰孢某些菌珠能产生腐马素，它与人类食管癌有关[6]。
同时，镰刀菌的可利用方面也是不容忽视的。在农业方面，一些镰刀菌在其生长发育过程中能分泌植物激素—赤霉素，可以促进植物的生长。许多镰刀菌是昆虫的病原真菌，还有一些镰刀菌可以寄生在真菌及线虫一类植物病原物上。近年来，人们利用弱致病性镰刀菌的交叉保护作用，来防治作物的镰刀菌病害。同时利用镰刀菌对寄生性植物杂草和其它病原微生物的寄生特性，应用于生物防治[12]。在工业生产上，镰刀菌可转化甾族化合物，又称类固醇，此类激素药物对机体起着非常重要的调节作用。因此在有机工业合成中应用镰刀菌发酵工艺使化工产品发生了工艺革新[11]。另外，利用禾谷镰孢（F.graminearum）生产真菌蛋白在英国已经注册，获准生产。
由此可见，镰刀菌是非常重要的真菌之一，而研究镰刀菌的各个方面都要以分类为
基础，因此对镰刀菌种类的研究有着重要意义。
迄今为止，所有的镰刀菌属分类系统都是以形态特征作为主要的分类依据。如大小型分生孢子的形态特征、包括分生孢子的整体形状，顶细胞，基细胞的形状，弯曲度，优势孢子的分隔数，长宽量度，分生孢子梗和产孢细胞的形态菌株培养特性等。 镰刀菌侵入植物体引起的植物镰刀菌病害，使农作物遭受重大损失，给农业生产带来很大危害，一些镰刀菌还能给人类健康也带来危害。但同时镰刀菌在农业生防及工业方面又有有益的一面。因此镰刀菌在工农医等方面都是一个非常重要的真菌，镰刀菌对于人类及环境具有有害和有益的双重性，它与人类关系十分密切，镰刀菌被认为是真菌中最具有经济价值的属之一。但是由于镰刀菌变异性大，不同学者对同一种镰刀菌病害种类的鉴定方面还存在着分歧。本试验对山西省植物病原镰刀菌种类进行分离和鉴定，这对山西省作物镰刀菌病害防治和丰富山西省的真菌种类资源有着重要意义。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试材料
采自山西省不同地区的5种疑似镰刀菌罹病植株。见表1
表1 供试菌株及来源
Table1 The tested strains and their locations
编号采集时间采集地点寄主及分离部位
12009.7 祁县北左棉花（根部）
22009.7 祁县下申豌豆（根茎）
32009.8 大同胡麻（根茎）
42009.8 交口胡麻（根茎）
52009.7 太谷（农大农作站）杭白菊（根茎）1.1.2 培养基类型
红薯粉生产设备1.1.
2.1 马铃薯蔗糖培养基（PSA 培养基）
马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000ml, 链霉素0.3 g（待培养基冷却至40～50℃时加入）。
1.1.
2.2 卓非（Joffe）修改的皮拉衣(Billai)培养基(简称Bilai,s)
磷酸二氢钾（KH2PO4）1 g，硝酸钾（KNO3）1 g，氯化钾（KCl）0.5 g，七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g，淀粉0.2 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，琼脂20 g，蒸馏水1000ml。
1.1.
2.3 米饭培养基
每支试管装入大米6 g，蒸馏水10 ml，灭菌后备用。
1.1.
2.4 绿豆培养基
每支试管装入绿豆6 g，蒸馏水10 ml，灭菌后备用。
1.1.3 仪器设备
生物显微镜、正置生物摄影显微镜、恒温培养箱、全自动灭菌锅、紫外超净工作台、数码照相机等。
1.2 镰刀菌研究方法
1.2.1 植株的采集
从山西省不同地区采集疑似镰刀菌引起的罹病植株，带回实验室进行分离。
1.2.2 镰刀菌的分离培养
1.2.2.1 植物组织分离法
对采集到的有明显子实体的样本先镜检，确定是否镰刀菌。对没有明显子实体的样本，则要先进行组织培养，取罹病植株距地面3到4厘米处的茎部组织，用无菌的刀片切成小段（约半cm左右），对于比较粗的材料在70%酒精中蘸几秒钟后，在酒精灯上掠过将酒精烧干，材料较细的，用70%酒精泡几秒钟后，无菌水冲洗3次，然后将材料表皮去掉，再在火焰上轻轻掠过，最后将处理过的病组织放入PSA平板上，每平板放4块材料，放入25℃的恒温培养箱中培养，待菌落长出后，镜检其是否镰刀菌。通过镜检确定有镰刀菌，但混杂其他杂均较多时，要接到事先准备好的平板上，经反复纯化后，进行单孢分离。如果菌种比较纯，则直接进行单孢分离。
1.2.2.2 单孢子分离
采用标准的稀释平板法分离孢子，即用一滴灭菌水滴在无菌的载玻片上，然后放在数码解剖镜下面，用无菌的挑针尖挑取聚集的孢子，然后将针尖深入载玻片上面的水滴中，就可以观察到孢子从挑针尖
上分散开并在水中流动，当孢子悬浮液已经满足需要之后，即将针尖取出，当孢子在水中可以清晰辨别，而不因重叠杂乱模糊不清为度，然后就可以用接种环取出一环孢子悬浮液在另一平板上划线[15]。
金属卤化物灯接线图1.2.2.3.显微形态观察
用灭菌的盖玻片在培养4天后Bilai,s平板上切取小块培养物，置于盖玻片上，在低倍镜下观察菌体形态特点，主要看其小孢子着生方式、产孢梗形态、子实体有无及菌体的整体形态特点，如小孢子是否串生或假头状着生，产孢梗单复瓶梗的辨别。
在培养4天后的PSA平板上用打孔器打取4mm大的菌碟，置于事先灭菌的放有盖玻片培养皿中的盖玻片上，每玻片放两块，然后放到25℃培养箱中培养一天半后，取出小培养，镜检其产孢方式，产孢梗形态。
分别于培养3天及6天后的PSA、Bilai,s平板上挑取菌体，制成临时玻片观察大小孢子、厚垣孢子、产孢梗及子实体形态。同时测量、记录孢子的大小尺寸。
1.2.3 镰刀菌鉴定
参考王拱辰的《常见镰刀菌鉴定指南》，陈鸿逵、王拱辰的《浙江镰刀菌志》以及Booth《镰刀菌属》
专著介绍的方法进行种类鉴定。
1.2.4 镰刀菌鉴定依据
1.2.4.1 培养性状
（1）生长速度：在pH5.6 左右的PSA 培养基上，24～25℃下，4d 后菌落生长直径。
（2）气生菌丝的形状：分为羊毛状、棉絮状、绒状、毡状、粉状，是否有粘孢团、粘滑层，气生菌丝稀疏或致密等。
（3）菌落泽：菌株培养2 周后记载泽（一般是在25℃的恒温培养箱中培养四天后，再在散射光下培养两周后记载泽）。PSA 上分别记载气生菌丝、基物表面、基物的颜；米饭和修改后的Bilai,s 培养基上则记载菌丝颜。泽名称根据《谱》一书进行记录。
1.2.2.4.2 形态特征
（1）小型分生孢子：数量多少或有无；形状有球形、梨形、柠檬形、卵形、椭圆形、纺锤形、披针形等；着生方式：单生或丛生，假头生或串生；分隔数一般0～2 个，大小2～20μm 不等。但有些镰刀菌，典型的小孢子没有或很少，而有一部分两分隔的分生孢子在形状等方面更像大孢子，这一部分孢子也被认定为大孢子。
（2）大型分生孢子：数量多少或有无；形状有桔瓣形、香蕉形、纺锤形、美丽形、马特形、镰刀形等，顶胞形状有钝形、渐尖、楔形、鸟嘴形等，基胞有或无足跟；分隔数大多在3 个或3 个以上，1 个的偶尔也有，有些甚至无分隔或分隔不明显；量度10～100μm 不等。
（3）产孢细胞：可分为单瓶梗、复瓶梗、层出梗等多种产孢方式。
（4）厚垣孢子：有无、形状、着生方式、数量多少以及大小。
（5）子实体类型：有无分生孢子座、粘孢团等。
（6）菌核；有无。
（7）子囊壳：有无及其形状
2 结果与分析微波电视天线
2.1 病株采集与病原菌分离纯化的结果
从棉花、胡麻、杭白菊、豌豆的罹病植株上共分离到58株真菌，经PSA培养基培养性状观察和简单的形态学分类和鉴定，分属于5种镰刀菌（对无明显大型分生孢子的菌株用绿豆培养基进行诱导），分
别为为潮湿镰胞（F.udum Butler），半裸镰胞（F.semitectum Brek.& Rav），尖胞镰胞（F.oxysporum Schlecht.），茄病镰胞（F.solani Sacc）。
2.2 鉴定结果
2.2.1 祁县北左棉花分离菌.
2.2.1.1 培养性状(见附录图1)
(1)生长速度：在PSA上25℃、4d的菌落直径为1.6～2.7cm。
(2)PSA上：气生菌丝毡状，白至粉红。基物表面白，基物不变。
(3)米饭上：白至淡黄。
(4) 修改的Bilai,s 培养基上：气生菌丝白稀疏。
2.2.1.2 形态特征(见附录图6)
(1)小型分生孢子：多，卵形、椭圆形，假头状着生。量度：6.67～12.54×1.51～3.54μm
(2)大型分生孢子：PSA上较多，圆筒形略弯，顶胞鸟嘴状或勾状，基胞足跟不明显。2-5分隔，多为2-3分隔。量度：10.67～36.23×2.01～4.52μm。
(3)产孢细胞类型：单瓶梗。
(4)厚垣孢子：球形，单个顶生或多个在菌丝中间串生。
表2大型分生孢子的分隔和量度
Table 2 The number of septum and the measurement of macroconidium.
分隔孢子数量度（µm）
1 2 11.62～15.11×2.13～3.65
2 15 15.85～27.71×2.92～3.42
3 23 19.77～35.74×3.75～4.50
4 3 27.66～36.23×3.39～4.52
根据以上培养性状及形态特征将该菌鉴定为潮湿镰胞（F.udum Butler）。
2.2.2 祁县下申豌豆分离菌.
2.2.2.1 培养性状(见附录图2)
(1)生长速度：在PSA上25℃、4d的菌落直径为3.3～4.2cm。
(2)PSA上：气生菌丝棉絮状，白至浅驼。基物表面肉，基物不变。
(3)米饭上：粉白。
(4) 修改的Bilai,s 培养基上：气生菌丝稀疏，白。
2.2.2.2 形态特征(见附录图7)
(1)小型分生孢子：少，纺锤形，椭圆形。多为0隔。量度：7.10～17.45×3.44～4.16μm
(2)大型分生孢子：纺锤形，基胞和基胞成楔形。2-5分隔，多为2-3分隔。量度：20.21～36.23×2.44～4.76μm。
(3)产孢细胞类型：单瓶梗和复瓶梗。
(4)厚垣孢子：球形，表面不光滑，单个顶生或多个在菌丝或孢子中间串生。
表3 大型分生孢子的分隔和量度
Table 3 The number of septum and the measurement of macroconidium.
分隔孢子数量度（µm）
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