菌种保存⽅法：
⼜有斜⾯培养、穿刺培养、疱⾁培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌⽤），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体⽯蜡覆盖保藏法
是传代培养的变相⽅法，能够适当延长保藏时间，它是在斜⾯培养物和穿刺培养物上⾯覆盖灭菌的液体⽯蜡，⼀⽅⾯可防⽌因培养基⽔分蒸发⽽引起菌种死亡，另⼀⽅⾯可阻⽌氧⽓进⼊，以减弱代谢作⽤。 3．载体保藏法
是将微⽣物吸附在适当的载体，如⼟壤、沙⼦、硅胶、滤纸上，⽽后进⾏⼲燥的保藏法，例如沙⼟保藏法和滤纸保藏法应⽤相当⼴泛。
4．寄主保藏法
⽤于⽬前尚不能在⼈⼯培养基上⽣长的微⽣物，如病毒、⽴克次⽒体、螺旋体等，它们必须在⽣活的动物、昆⾍、鸡胚内感染并传代，此法相当于⼀般微⽣物的传代培养保藏法。病毒等微⽣物亦可⽤其他⽅法如液氮保藏法与冷冻⼲燥保藏法进⾏保藏。
5．冷冻保藏法
可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、⼲冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。常⽤的有⽢油菌保存：
取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%⽢油的加⼊量，保存零下80度。例：取37°培养过夜的菌液2-4ml⽢油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。
6．冷冻⼲燥保藏法
先使微⽣物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利⽤升华现象除去⽔分（真空⼲燥）。
有些⽅法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻⼲燥保藏法等均需使⽤保护剂来制备细胞悬液，以防⽌因
冷冻或⽔分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离⼦键对⽔和细胞所产⽣的亲和⼒来稳定细胞成分的构型。保护剂有⽜乳、⾎清、糖类、⽢油、⼆甲亚砜等。⼆.常⽤的器材
所要保存的微⽣物；
⾁膏蛋⽩胨斜⾯培养基，灭菌脱脂⽜乳，灭菌⽔，化学纯的液体⽯蜡，⽢油，五氧化⼆磷，河沙，瘦黄⼟或红⼟，冰块、⾷盐，⼲冰，95％酒精，10％盐酸，⽆⽔氯化钙；
灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养⽫，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40⽬与100⽬筛⼦，油纸，滤纸条
（0．5×1．2cm），⼲燥器，真空泵，真空压⼒表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
三.各操作步骤、各保藏法的应⽤范围及优缺点
1．斜⾯低温保藏法
将菌种接种在适宜的固体斜⾯培养基上，待菌充分⽣长后，棉塞部分⽤油纸包扎好，移⾄2—8℃的冰箱中保藏。
保藏时间依微⽣物的种类⽽有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个⽉，移种⼀次。酵母菌两个⽉，细菌最好每⽉移种⼀次。
此法为实验室和⼯⼚菌种室常⽤的保藏法，优点是操作简单，使⽤⽅便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、
化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微⽣物的代谢改变，⽽影响微⽣物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
2．液体⽯蜡保藏法
（1）将液体⽯蜡分装于三⾓烧瓶内，塞上棉塞，并⽤⽜⽪纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使⽔汽蒸发掉，备⽤。
（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜⾯培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢⼦。（3）⽤灭菌吸管吸取灭菌的液体⽯蜡，注⼊已长好菌的斜⾯上，其⽤量以⾼出斜⾯顶端1cm 为准（图Ⅶ-12），使菌种与空⽓隔绝。
（4）将试管直⽴，置低温或室温下保存（有的微⽣物在室温下⽐冰箱中保存的时间还要长）。
此法实⽤⽽效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，⼀般⽆芽孢细菌也可保藏1年左右，甚⾄⽤⼀般⽅法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个⽉之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直⽴放置，所占位置较⼤，同时也不便携带。从液体⽯蜡下⾯取培养物移种后，接种环在⽕焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体⽯蜡⼀起飞溅，应特别注意。3．滤纸保藏法
（1）将滤纸剪成0．5×1．2cm的⼩条，装⼊0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟。
（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜⾯培养基上培养，使充分⽣长。
（3）取灭菌脱脂⽜乳1—2ml滴加在灭菌培养⽫或试管内，取数环菌苔在⽜乳内混匀，制成浓悬液。
（4）⽤灭菌镊⼦⾃安瓿管取滤纸条浸⼊菌悬液内，使其吸饱，再放回⾄安瓿管中，塞上棉塞。
（5）将安瓿管放⼊内有五氧化⼆磷作吸⽔剂的⼲燥器中，⽤真空泵抽⽓⾄⼲。
（6）将棉花塞⼊管内，⽤⽕焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。
（7）需要使⽤菌种，复活培养时，可将安瓿管⼝在⽕焰上烧热，滴⼀滴冷⽔在烧热的部位，使玻璃破裂，再⽤镊⼦敲掉⼝端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放⼊液体培养基内，置温箱中培养。
细菌、酵母菌、丝状真菌均可⽤此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚⾄可保藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻⼲燥法简便，不需要特殊设备。
4．沙⼟保藏法
（1）取河沙加⼊10％稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。
（2）倒去酸⽔，⽤⾃来⽔冲洗⾄中性。
（3）烘⼲，⽤40⽬筛⼦过筛，以去掉粗颗粒，备⽤。彩灯控制电路
（4）另取⾮耕作层的不含腐植质的瘦黄⼟或红⼟，加⾃来⽔浸泡洗涤数次，直⾄中性。（5）烘⼲，碾碎，通过100⽬筛⼦过筛，以去除粗颗粒。
（6）按⼀份黄⼟、三份沙的⽐例（或根据需要⽽⽤其他⽐例，甚⾄可全部⽤沙或全部⽤⼟）掺合均匀，装⼊10×100mm的⼩试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进⾏灭菌，烘⼲。
（7）抽样进⾏⽆菌检查，每10⽀沙⼟管抽⼀⽀，将沙⼟倒⼊⾁汤培养基中，37℃培养48⼩时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作⽆菌试验，直⾄证明⽆菌，⽅可备⽤。（8）选择培养成熟的（⼀般指孢⼦层⽣长丰满的，营养细胞⽤此法效果不好）优良菌种，以⽆菌⽔洗下，制成孢⼦悬液。
（9）于每⽀沙⼟管中加⼊约0．5ml（⼀般以刚刚使沙⼟润湿为宜）孢⼦悬液，以接种针拌
匀。
（10）放⼊真空⼲燥器内，⽤真空泵抽⼲⽔分，抽⼲时间越短越好，务使在12⼩时内抽⼲。
（11）每10⽀抽取⼀⽀，⽤接种环取出少数沙粒，接种于斜⾯培养基上，进⾏培养，观察⽣长情况和有⽆杂菌⽣长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙⼟管有问题，尚须进⼀步抽样检查。
（12）若经检查没有问题，⽤⽕焰熔封管⼝，放冰箱或室内⼲燥处保存。每半年检查⼀次活⼒和杂菌情况。
（13）需要使⽤菌种，复活培养时，取沙⼟少许移⼊液体培养基内，置温箱中培养。
正交相移键控此法多⽤于能产⽣孢⼦的微⽣物如霉菌、放线菌，因此在抗⽣素⼯业⽣产中应⽤最⼴，效果亦好，可保存2年左右，但应⽤于营养细胞效果不佳。
5．液氮冷冻保藏法
（1）准备安瓿管⽤于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化⽽不致破裂，因此，需要采⽤硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的⼤⼩通常使⽤75×10mm的，或能容1．2mm 液体的。
（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢⼦等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体⽤则需在安瓿管内预先加⼊保护剂如10％的⽢油蒸馏⽔溶液或10％⼆甲亚砜蒸馏⽔溶液，加⼊量以能浸没以后加⼊的菌落圆块为限，⽽后再⽤1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌15分钟。
（3）接⼊菌种将菌种⽤10％的⽢油蒸馏⽔溶液制成菌悬液，装⼊已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可⽤灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放⼊含有保护剂的安瓿管内，然后⽤⽕焰熔封。浸⼊⽔中检查有⽆漏洞。
（4）冻结再将已封⼝的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结⾄-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因⽽降低存活率。
（5）保藏经冻结⾄-30℃的安瓿管⽴即放⼊液氮冷冻保藏器（图Ⅶ-14）的⼩圆筒内，然后再将⼩圆筒放⼊液氮保藏器内。液氮保藏器内的⽓相为-150℃，液态氮内为-196℃。（6）恢复培养保藏的菌种需要⽤时，将安瓿管取出，⽴即放⼊38—40℃的⽔浴中进⾏急剧解冻，直到全部融化为⽌。再打开安瓿管，将内容物移⼊适宜的培养基上培养。
此法除适宜于⼀般微⽣物的保藏外，对⼀些⽤冷冻⼲燥法都难以保存的微⽣物如⽀原体、⾐原体、氢细菌、难以形成孢⼦的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，⽽且性状不变异。缺点是需要特殊设备。
6．冷冻⼲燥保藏法
（1）准备安瓿管⽤于冷冻⼲燥菌种保藏的安瓿管宜采⽤中性玻璃制造，形状可⽤长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管（图Ⅶ-15），⼤⼩要求外径6—7．5mm，长105mm，球部直径9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可⽤没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，备⽤。
（2）准备菌种，⽤冷冻⼲燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年⾄⼗数年，为了在许多年后不出差错，故所⽤菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中⽤最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数⽣长期，若⽤对数⽣长期的菌种进⾏保藏，其存活率反⽽降低。⼀般，细菌要求24—48⼩时的培养物；酵母需培养3天；形成孢⼦的微⽣物则宜保存孢⼦；放线菌与丝状真菌则培养7—10天。
（3）制备菌悬液与分装以细菌斜⾯为例，⽤脱脂⽜乳2ml左右加⼊斜⾯试管中，制成浓菌液，每⽀安瓿管分装0．2ml。
（4）冷冻冷冻⼲燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易⽅法与装置，可达
到同样的⽬的。
将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，⽆低温冰箱可⽤冷冻剂如⼲冰（固体CO2>）酒精液或⼲冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插⼊冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。
（5）真空⼲燥为在真空⼲燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与⾷盐，混合均匀，可冷⾄-15℃。装置仪器如图Ⅶ-16，安瓿管放⼊冷冻槽中的⼲燥瓶内。
抽⽓⼀般若在30分钟内能达到93．3Pa（0．7mmHg）真空度时，则⼲燥物不致熔化，以后再继续抽⽓，⼏⼩时内，⾁眼可观察到被⼲燥物已趋⼲燥，⼀般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持压⼒6—8⼩时即可。
（6）封⼝抽真空⼲燥后，取出安瓿管，接在封⼝⽤的玻璃管上，可⽤L形五通管（图Ⅶ-17）继续抽⽓，约10分钟即可达到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空状态下，以煤⽓喷灯的细⽕焰在安瓿管颈中央进⾏封⼝。封⼝以后，保存于冰箱或室温暗处。
此法为菌种保藏⽅法中最有效的⽅法之⼀，对⼀般⽣活⼒强的微⽣物及其孢⼦以及⽆芽胞菌都适⽤，即使对⼀些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适⽤于菌种长期保存，⼀般可
保存数年⾄⼗余年，但设备和操作都⽐较复杂。对于⼀般的⼤肠杆菌等基因⼯程菌，我们室常⽤的⽅法是：
取原种100微升，在3ml适当培养基（2*YT，LB等），加好抗⽣素，
37度摇菌过夜；
次⽇取50%⽢油（已⾼压）与培养的菌液按1：1⽐例混匀（专⽤的菌种冻存管），—20度保存。
每次使⽤于冰上操作，动作要快。
另外⼩量分装冻存，避免反复冻融影响细菌质量。菌种是⼀种重要的⽣物资源，菌种保藏是重要的微⽣物基础⼯作。菌种保藏就是利⽤⼀切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应⽤。
(⼀)常规保藏⽅法
2原理
菌种保藏的⽅法很多。其原理却⼤同⼩异，不外乎为优良菌株创造⼀个适合长期休眠的环境，即⼲燥、低温、缺乏氧⽓和养料
等。使微⽣物的代谢活动处于最低的状态，但⼜不⾄于死亡，从⽽达到保藏的⽬的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选⽤不同的保藏⽅法。⼀般情况下，斜⾯保藏、半固体穿刺,⽯蜡油封存和砂⼟管保藏法较为常⽤，也⽐较容易制作。
3材料
3.1菌株
待保藏的适龄菌株斜⾯
3.2培养基
⾁汤蛋⽩胨斜⾯，半固体及液体培养基。
3.3试剂
10%HCl⽆⽔氯化钙、⽯蜡油、五氧化⼆磷。
3.4器具
⽤于菌种保藏的⼩试管(10*100毫⽶)数⽀、5毫升⽆菌吸管、l毫升⽆菌吸管等、灭菌锅、真空泵、⼲
燥器、冰箱⽆菌⽔、筛⼦(40⽬、120⽬)、标签、接种针、接种环、棉花、⽜⾓匙等等。
4流程
斜⾯保藏→半固体穿刺保藏→⽯蜡油封存→砂⼟管保藏
led天花灯电源5步骤
5.1斜⾯保藏
5.1.1流程
标记试管→接种→培养→保藏
5.1.2步骤
5.1.2.1贴标签
取⽆菌的⾁汤蛋⽩胨斜⾯数⽀。在斜⾯的正上⽅距离试管⼝2-3厘⽶处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种⽇期。
5.1.2.2斜⾯接种
将待保藏的细菌⽤接种环以⽆菌操作在斜⾯上作划线接种。
5.1.2.3培养
置37恒温箱中培养48⼩时。
5.1.2.4保藏
斜⾯长好后，直接放⼊4℃的冰箱中保藏。这种⽅法⼀船可保藏三个⽉⾄半年。
5.2半固体穿刺保藏
向初5.2.1流程
标记试管→穿刺接种→培养→保藏
5.2.2步骤
5.2.2.1贴标签
取⽆菌的半固体⾁汤蛋⽩等直⽴柱数⽀，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种⽇期。
5.2.2.2穿刺接种
⽤接种针以⽆菌⽅式从待保藏的细菌斜⾯上挑取菌种，朝直⽴柱中央直刺⾄试管底部，然后⼜沿原线拉出。
5.2.2.3培养
置37恒温箱中培养48⼩时。
5.2.4保藏
半固体直⽴柱长好以后，放⼊4℃的冰箱中保藏。这种⽅法⼀般可保藏半年⾄⼀年。
5.3⽯蜡油封存
5.3.1流程
标记试管→接种→培养→加⽯蜡油→保藏
5.3.2步骤
5.3.1标记
同5.1.2.1
5.3.2接种
同5.1.2.2
5.3.3培养
同5.1.2.3
5.3.4加⽯蜡油
⽆菌操作下将5毫升⽯蜡油到培养好的菌种上⾯，加⼊的量以超过斜⾯或直⽴柱1厘⽶⾼为宜。
5.3.5保藏：⽯蜡油封存以后，同样放⼊4℃冰箱中保存。也可直接放在低温⼲燥处保藏。这种⽅法保藏期⼀般为⼀⾄⼆年。
5.4砂⼟管保藏
5.4.1流程
制沙⼟管→灭菌→制菌液→加样→⼲燥→保藏
5.4.2步骤
5.4.2.1制作沙⼟管
选取过40⽬筛的黄砂，酸洗，再⽔洗⾄中性，烘⼲备⽤；过120⽬筛⼦的黄⼟备⽤；按1份⼟加4份砂的⽐例均匀混合后，装⼊⼩试管，装量1厘⽶左右。
5.4.2.2灭菌
加压蒸汽灭菌，直⾄检测⽆菌为⽌。
5.4.2.3制备菌液
取3毫升⽆菌⽔⾄待保藏的菌种斜⾯中，⽤接种环轻轻刮下菌苔。震荡制成菌悬液。se110
5.4.2.4加样
⽤1毫升吸管吸取上述悬液0.1毫升⾄砂⼟管，再⽤接种环拌匀。
5.4.2.5⼲燥
把装好菌液的砂⼟管放⼊⼲燥器或同时⽤真空泵连续抽⽓，使之⼲燥。
5.4.2.6保藏
⼲燥后的砂⼟管可直接放⼊冰箱中保藏；也可以⽤⽯蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。（⼆）冷冻⼲燥保藏法石竹素
2原理
冷冻⼲燥保藏菌种法可克服简单保藏⽅法的不⾜。利⽤有利于菌种保藏的—切因素，使微⽣物始终处于低温、⼲燥、缺氧的条件下，因⽽它是迄今为⽌最有效的菌种保藏法之⼀。
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