第一节蛋白质组学的产生背景
人类基因组计划已经告一段落，对人类基因组的测序工作已经完成。基因组学取得的成果是非常令人振奋的，但是也随之产生了新问题。大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。不仅如此，在细胞合成蛋白质之后，这些蛋白质往往还要经历翻译后的加工修饰。也就是说，一个基因对应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十种。包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。正是在此背景下，蛋白质组学(proteomics)应运而生。 蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯(Marc Wilkins)最先提出来的，最早见诸于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上，它是指一个有机体在特定时期的全部蛋白质组成及其活动方式。蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段，但已经取得了一些重要进展。当前蛋白质组学的主要内容是，在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时，进行蛋白质组分析。对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。一方面，通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱，相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过互联网检索。二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。蛋白质组分析的另一方面，
是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化，翻译后修饰的变化，或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。为此，需要借助一些高通量、快速、准确、自动化程度高的技术和手段对研究对象进行处理，如激光显微切割技术、双红外荧光检测技术、高通量全自动蛋白纯化及分析系统以及蛋白芯片技术等。
细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物，蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。蛋白质间的相互作用及作用方式同样也是蛋白质组研究所面临的问题。研究蛋白质间的相互作用有多种方法，常用的如酵母双杂交系统、亲和层析、免疫沉淀、蛋白质交联等。其中，酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用广泛的主要方法。
第二节蛋白质组学及研究技术路线
2.1蛋白质组学的研究内容
1）蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western blot等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。
中央排水管
2）翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。
3）蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术以及干扰RNA技术分析基因表达产物--蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。
4）对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学
的发展。如寻药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。
在基础医学和疾病机理研究中，了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。
2.2蛋白质组学研究技术路线
不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的，因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。可以利用免疫组织化学技术达到这个目的，但该技术的致命缺点是通量低。LCM技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型，因此LCM技术实
际上是一种原位技术。取出的细胞用于蛋白质样品的制备，结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线，可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究。很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线，其研究结论值得怀疑，因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起，最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在每类细胞中的表达情况。虽然培养细胞可以得到单一类型细胞，但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境，因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离，分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达研究，包括mRNA和蛋白质的表达。
LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。可以根据需要制备总蛋白，或膜蛋白，或核蛋白等，也可以富集糖蛋白，或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染如银染和荧光染。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。
胶染后可以利用凝胶图象分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴
趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据；这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。实际上像人类的血浆，尿液，脑脊液，乳腺，心脏，膀胱癌和鳞状细胞癌及多种病原微生物的蛋白质样品的二维电泳数据库已经建立起来，读者可以登录pasy.ch/www/tools.html等网站进行查询。
LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型，制备细胞蛋白质样品，蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交，从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。一张抗体芯片可以对近400种膜蛋白和胞浆蛋白进行分析。
对于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。Clontech开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究者选用。
关于蛋白质组的研究，也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片，这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究，蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。
最后有必要指出的是，传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理
或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。适应这个要求，蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自动化的系统，通量高而速度快，配合相应分析软件和数据库，研究者可以在最短的时间内处理最多的数据。
图一蛋白组学流程图
第三节蛋白组学常用技术
3.1LCM-双向电泳－质谱
一、激光俘获显微切割技术
蛋白组学分析的对象是特定组织细胞在特定时间的蛋白表达，因此从组织中分离出单一细胞就显得非常重要。常规的显微镜下手工分离不可避免会有其他细胞混杂，经典的细胞培养虽可以得到单一细胞，但体外培养的细胞和在体细胞必定有差异，因此不能完美的建立细胞模型。
LCM即激光俘获显微切割技术（laser capture microdissection），其过程可概括如下：首先在组织切片上覆盖一层透明的膜，在显微镜下观察该组织切片，选择某一特殊细胞后，
t恤转印纸开启脉冲式红外激光束，使膜融化变得粘性很强(该膜的成份为Ethylene Vinyl Acetate Polymer)，等到冷却后将该位置的细胞牢固地粘附在上面从而分离细胞。
该种方法较以往方法改进之处：首先，它简单，不需要移动任何切片部位，一步即可完成从组织中分离特殊细胞，这些在膜上的细胞依然保持其原有的形态，使用无菌、一次性的膜可最大限度地避免可
能的污染。其次，使膜活化所需的激光能量很小(<50mW)，与常规显微配合是充足的，完全能够满足临床病理组织细胞显微分离的需要。再者，LCM 技术分离细胞速度较以往方法有很大提高，例如，从肾组织切片中分离一个肾小球(Glomerulus)所需时间小于10秒，一小时内即可轻松地分离上百个肾小球。手工分离方法远远不能达到该速度。由于组织切片固定，操作者可以反过来确定所分离的细胞是不是正确的靶细胞，而手工机械显微分离可能会引起周围其它细胞一块松动，污染靶细胞。
得到目的细胞后就可以从细胞中提取总蛋白进行分析，但是由于最灵敏的双向电泳也只能区分2000－3000种蛋白，所以在蛋白提取过程中可以分类制备，如分别提取膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白、骨架蛋白、线粒体蛋白、内质网蛋白等，也可以根据蛋白溶解性分别制备最可溶、中等可溶、不可溶、高度不可溶和最不可溶蛋白。
二、双向电泳
双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)是分析从细胞、组织或其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛应用的方法。这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向步骤——等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（pI）将蛋白质分离。在第二向步骤中SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量（Mr，相对分子量）大小将它们分离。双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
概括起来，双向电泳的实验步骤为:
1、样品的制备
耐高温盘根2、IPG干胶条的再水化
3、等电聚焦电泳（IEF）
4、IPG胶条平衡
5、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
6、染
7、结果分析
双向电泳从样品制备开始。正确的样品制备方法对得到好的双向电泳结果相当重要。双向电泳下一个步骤是IPG干胶条的再水化。购得的IPG胶条是干制的，在等电聚焦（IEF）之前必须将IPG干胶条在含有合适的试剂的溶液中进行水化。第一向等电聚焦是在有温度控制和高电压的条件下的平板电泳仪上进行。接下来，为了进行第二向的分离，IPG胶条在含有SDS的缓冲液中进行平衡。平衡后，将IPG胶条放在第二向凝胶上进行电泳。最后的步骤是进行染及对双向电泳点阵结果进行分析。
（一）样品制备
样品制备方法多种多样，在实验中应该做到具体问题具体分析，用不同方法提取不同种类蛋白样品。基本原则是组织处理前-80℃保存，避免反复冻融；细胞裂解应适当；蛋白酶抑制要充分；样品缓冲液盐浓度要合理，不能改变蛋白pI值，防止蛋白被修饰。
（二）双向电泳
双向电泳的两次电泳可以在同一个电泳以上进行也可以分开进行水平及垂直电泳，Amersham Biosciences公司的MultiphorⅡ(图1)是一台多功能仪器，对于双向电泳，它既能进行第一向电泳（IEF），也能进行第二向电泳（SDS-PAGE）。但它所需附件设备较多，
而且电压较低，等电聚焦所需时间较长；Ettan IPGphor（图2）等电聚焦系统仅用于第一向电泳，但操作简单，聚焦时间短。第二向电泳即SDS－PAGE（十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳）它可以在MultiphorⅡ上水平进行，也可以在其它电泳仪上进行垂直电泳，不同的装置对胶条的规格有不同要求并且分辨率也有较大差异，可以根据实验目的选择电泳装置。
图二Multiphor II平板电泳仪
从左向右依次是电源、电泳槽、控温仪和胶条处理器
图三Ettan IPGphor电泳仪
1.等电聚焦(IEF)
（1）原理
等电聚焦（isoelectric focus IEF）技术是根据蛋白质的等电点（pI）不同将它们分开的一种电泳技术。蛋白质是两性分子；它们整个分子要么带有正电或负电，要么不带电，这依赖于环境的pH值。整个蛋白质分子的带电量取决于组成蛋白质的氨基酸的侧链及羧基端和氨基端所有电荷的总合。等电点(isoelectric point,pI)是一个特定的pH值，此时整个蛋白质分子的净电荷为零。蛋白质在环境pH值低于pI时带正电，而高于pI值时带负
电。所带净电荷量与pI和环境pH的距离有关，二者偏差越大，蛋白质分子所带电荷越多；反之，二者越接近，蛋白质分子带电越少。
消息钩子
pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。在pH梯度凝胶内，在电场作用下，蛋白质分子能向使它们所带净电荷为零的点移动。蛋白质若所带电荷为正，则它向负极移动，在它到达pI点位置之前在它们通过pH梯度时，其所带的正电荷会逐渐减弱。带负电的蛋白质则要向正极移动，所带的负电荷会逐渐减少直至为零。如果蛋白质偏离等电点，其立即带上电荷而返回等电点的位置。这就是等电聚焦的聚焦效应，能将蛋白质在其等电点上浓缩，并根据所带电荷微小的差异，能将蛋白质分离。
分离的程度取决于pH梯度斜率和电场强度。因此，等电聚焦是在相当高的电压下进行的（一般超过1000V）。当蛋白质在pH梯度上都达到最终点时，在整个体系中很少有离子的移动，从而使最终电流很低（往往低于mA）。给定样品在给定电泳体系中进行等电聚焦，一般要达一定伏小时【伏小时(Vh)是电压对于作用时间积分】。
等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。
（2）背景太阳能安全帽
原先的第一向等电聚焦依靠载体两性电解质在聚丙烯酰胺管胶内产生的pH梯度将蛋白质分离。载体两性电解质分子非常小，溶于水，在它们的pI值附近有很高的缓冲能力。商品化的载体两性电解质混合物由数百种聚合物组成，这些复合物的等电点在特定pH值跨度之内。当电压加到载体两性电解质混合物上时，高pI的载体两性电解质(带正电荷)向负极移动，低pI值(带负电荷)的则向正极移动，其它的载体两性电解质根据它们的pIs 分别分布在这两极端之间，并且使其周围环境缓冲在相应的pH值上。结果产生连续的pH 梯度。
尽管这种基本方法曾广泛用于双向电泳的研究，但具有一些限制它们更广泛使用的局限性：
·
载体两性电解质是混合的复合物，很难定性，且存在生产批次差异的问题。这些差异降低了第一向分离的重复性。
·载体两性电解质pH梯度不稳定且易漂移，在电泳过程中往往向负极漂移。通过引入时间变量，梯度漂移反过来能影响电泳的重复性。梯度漂移也能在pH梯度两端造成pH梯度平均化，尤其是pH值高于9时，从而使使双向电泳分离在pH梯度两端失去作用。步进式加热炉
·柔软的聚丙烯酰胺管胶的机械强度低。胶棒有可能被拉长或断裂，从而影响电泳的重复性。电泳结果好坏往往依赖操作者的熟练程度。
使用IPG（immobilized pH gradients）胶条进行双向电泳的第一向电泳后使得等电聚焦变得操作简单，重复性好。在凝胶灌制时，将酸性和碱性的缓冲基团共价结合入聚丙烯酰胺凝胶而形成固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)。缓冲液含有一组特定的分子，每一个都是带一个酸性或碱性缓冲基团的丙烯酰胺单体。它们的一般结构如下：
CH2=CH-C-NH-R
‖
O
R=弱酸性或弱碱性缓冲基团
固相pH梯度是由使用两种溶液形成的，一种包含相对酸性的混合物，另一种包含相对碱性的混合物。在两种溶液中不同缓冲液的浓度决定着pH梯度的范围和状态的形成。两种溶液都含有丙稀酰胺单体和催化剂。在聚合过程中，缓冲液的丙稀酰胺部分与丙稀酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体共同聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。
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