集束线李莉;柳燕;林源;赵珍敏
【摘 要】目的 用ESI-TOF-MS分型技术检测线粒体DNA的D环高变区,通过碱基组成分析其多态性.方法 在PLEX-ID技术平台上,分别对mtDNA高变区1(HVⅠ,15924-16428nt)和mtDNA高变区Ⅱ(HVⅡ,31-576 nt)进行碱基组成分析,考察mtDNA在华东汉族人的多态性,并将该技术应用于一例特殊的亲子鉴定案件.结果 用ESI-TOF-MS分型技术检测线粒体DNA,在高变区Ⅰ的8个区段检见碱基组成的多态性,在mtDNA高变区Ⅱ的10个区段检见多态性.在所应用的亲子鉴定案例中,线粒体DNA标记成了常染体STR基因座的重要补充,经高变区Ⅰ和高变区Ⅱ的碱基组成检测,最后排除了非母.结论 ESI-TOF-MS检测mtDNA的技术具有良好的应用前景,在一些特殊的案件中,该法可为最终获得可靠鉴定结论提供技术支撑. 【期刊名称】《中国司法鉴定》
【年(卷),期】2013(000)004
【总页数】马蹄削皮机6页(P40-44,54)
【关键词】法医遗传学;线粒体DNA;ESI-TOF-MS;PLEX-ID;SNP
钛靶材
【作 者】李莉;柳燕;林源;赵珍敏
【作者单位】司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室,上海200063;司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室,上海200063;司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室,上海200063;司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室,上海200063
【正文语种】中 文
【中图分类】DF795.4
线粒体DNA（mtDNA）在法医生物学鉴定中具有独特价值，可用于母系关系检验，亦能作为辅助检测手段用于同胞关系鉴定等，在亲权鉴定中发挥重要作用。另外，由于线粒体DNA在细胞内呈现多拷贝状态，可在核DNA检验难以成功时尝试用于陈旧骨、牙、毛干等检材的检验[1-2]，在个体识别中也发挥特殊作用。
mtDNA基因组的控制区（D环）存在两个多态性区域：高变区Ⅰ（16024～16365nt）和高变区Ⅱ（73～340nt）。Sanger测序即双脱氧末端终止法[3-4]是法医DNA实验室通用的检测高变区核苷酸序列的方法。但是，测序方法比较繁琐，且遇到DNA模板序列中有多个碱基C相连时（P olyC）往往导致测序结果难以判读；其次，由于当前通用的测序手段所得的信息量不大，人中的无关个体极有可能具有相同的检测结果，因而在个体识别中的价值比较有限。目前，有学者报道了线粒体基因组全测序的价值[5]，该法所获得的信息量大，但是其成本较高，尚不宜推广使用。
本研究采用电喷雾飞行时间质谱（ESI-TOF-MS）[6]技术检测mtDNA，该法分型准确、不受模板序列中Poly C的影响，通过碱基组成反映样本mtDNA D环高变区的特征，结果报告方式灵活，在法医学上具有良好的应用前景[7-8]。本文用该技术检测了线粒体DNA高变区碱基组成在华东汉族体的多态性，并通过实际案例的应用探讨了该技术的应用价值。
1 材料与方法
1.1 样本
在知情同意基础上，采集华东地区12名汉族无关个体枸橼酸钠抗凝外周血，200μL/人。
1.2 方法
1.2.1 DNA抽提
取枸橼酸钠抗凝血200μL，采用微量血液DNA抽提试剂盒（QIAamp Mini Blood试剂盒，德国Qiagen公司）提取基因组DNA。
1.2.2 mtDNA检测
箱式高温煅烧炉通过Abbott公司提供PLEX-ID平台的技术服务完成样本mtDNA的检测。该平台使用24对引物[7]，采用8个三重PCR扩增体系[1，7]联合电喷雾离子化飞行质谱技术（ESI-TOFMS）检测mtDNA高变区Ⅰ和高变区Ⅱ各12个区段的碱基组成（即A、G、C、T四种碱基的数量），相邻的两个区段之间有2～22个碱基的重叠。整个技术流程包括PCR扩增、纯化和PCR产物在PLEX-ID平台的分型[6]。为了验证结果的准确性，除了设置已知分型结果（该结果已先期经过测序验证）的样本作为阳性对照之外，还从体抽取2个样本同时用测序平台和PLEX-ID平台进行检测；对于PLEX-ID平台的结果，既报告碱基组成信息，亦通过后台数据库的比对报告其核苷酸序列特征，将结果进行比对，考察一致性。
为了考察PLEX-ID平台的实际应用价值，选择了一个特殊的母子关系鉴定案例，该案例中的被检母亲与被检男孩经D19S433等46个STR基因座的检测，均未能排除亲子关系，经用汉族体的等位基因分布频率计算累积母权指数（CMI），发现似然比率高达3.3×1013。但是，经调查，被检母亲与男孩是事实上的姑侄关系。本文用PLEX-ID平台对该案例的检材进行了mtDNA的补充检测。 3 结果
3.1 质控结果
检测过程所设置的阳性结果正确。高变区Ⅱ309-315nt是碱基C集中分布、通常测序最难以分辨的区域，但PLEX-ID平台检测的结果表明，该区域质谱分辨效果理想。从体抽取的2个样本同时用测序平台和PLEX-ID平台进行检测，结果一致。
频率补偿电路3.2 mtDNA高变区碱基组成的多样性
网约车管理系统经对华东汉族12名无关个体进行检测，获得mtDNA高变区碱基组成的多样性信息，各类型的分布频率见表1。
表1 高变区24个区段各种碱基组成类型的分布频率分布频率2901 15924..15985： A24 G10 C14 T14 0.0833 A25 G9 C14 T14 0.9167 2925 15963..16017 A22 G4 C13 T16 1.0000 2899 16015..16051 A7 G10 C5 T15 1.0000 2898 16048..16098 A15 G7 C16 T13 1.0000 2897 16078..16129 A15 G8 C13 T16 0.0833 A15 G8 C14 T15 0.7500 A16 G7 C14 T15 0.1667 2896 16124..16201 A26 G7 C29 T15 0.0588 A26 G7 C30 T15 0.0588 A26 G7 C31 T15 0.0588 A26 G7 C32 T15 0.0588 A26 G8 C27 T17 0.1177 A27 G7 C27 T17 0.3531 A27 G7 C28 T16 0.0588 A28 G6 C27 T17 0.0588 A28 G6 C28 T16 0.0588 A28 G6 C29 T16 0.0588 A28 G6 C30 T16 0.0588引物编号1）扩增区域碱基组成多态性分布频率2895 16157..16201 A16 G1 C20 T7 0.0555 A16 G1 C21 T7 0.0555 A16 G1 C22 T7 0.0555 A16 G1 C23 T7 0.0555 A16 G2 C18 T9 0.0555 A16 G2 C19 T8 0.0555 A17 G1 C19 T7 0.0555 A17 G1 C19 T8 0.3892 A17 G1 C20 T7 0.1113 A17 G1 C21 T7 0.0555 A17 G1 C22 T7 0.0555 2893 16182..16250 A23 G5 C30 T10 0.0588 A23 G5 C31 T10 0.0588 A23 G5 C32 T10 0.0588 A23 G5 C33 T10 0.0588 A24 G5 C26 T14 0.0588 A24 G5 C27 T13 0.5296 A24 G5 C28 T12 0.0588 A24 G5 C28 T13 0.0588引物编号1）扩增区域碱基组成多态性
续表1注：1）引物编号源自文献7中的编号分布频率A24 G5 C29 T13 0.0588 2892 16254..16305 A18 G4 C21 T9 0.1667 A18 G4 C22 T8 0.2500 A18 G4 C23 T7 0.2500 A18 G4 C24 T6 0.2500 A19 G3 C23 T7 0.0833 2891 16283..16344 A24 G5 C18 T15 0.0833 A24 G5 C19 T14 0.1667 A24 G5 C20 T13 0.3334 A24 G5 C21 T12 0.0833 A25 G4 C17 T16 0.0833 A25 G4 C18 T15 0.2500 2890 16342..16381 A8 G5 C17 T10 0.7500 A8 G5 C18 T9 0.2500 2889 16377..16428 A12 G9 C20 T11 1.000 2902 31..76 A5 G16 C10 T15 0.9167 A5 G16 C11 T15 0.0833 2903 41..114 A12 G25 C19 T18 0.9167 A12 G25 C20 T18 0.0833 2904 103..162 A10 G10 C17 T23 0.2143 A10 G10 C18 T22 0.3571 A10 G10 C19 T21 0.3571 A11 G10 C18 T21 0.0715 2905 138..217 A23 G9 C17 T31 0.0667 A23 G9 C18 T30 0.3333 A23 G9 C19 T29 0.3333 A23 G9 C20 T28 0.0667 A24 G8 C19 T29 0.1333 A24 G9 C19 T28 0.0667引物编号1）扩增区域碱基组成多态性分布频率2906 178..267 A31 G15 C14 T29 0.0769 A31 G15 C15 T28 0.2308 A32 G15 C14 T29 0.3847 A32 G15 C15 T28 0.1538 A33 G14 C14 T29 0.0769 A33 G14 C16 T27 0.0769 2908 234..313 A29 G6 C29 T16 0.1332 A29 G6 C31 T16 0.0667 A30 G6 C29 T16 0.2667 A30 G6 C30 T16 0.2667 A30 G6 C31 T16 0.2667 2907 263..340 A25 G6 C34 T14 0.3125 A25
G6 C35 T14 0.1875 A25 G6 C36 T14 0.3125 A26 G5 C34 T14 0.0625 A26 G5 C35 T14 0.0625 A26 G5 C36 T14 0.0625 2923 289..367 A27 G6 C35 T12 0.3750 A27 G6 C36 T12 0.2500 A27 G6 C37 T12 0.3750 2910 355..401 A21 G3 C14 T9 1.000 2916 389..437 A11 G7 C12 T19 1.000 2912 431..501 A20 G1 C34 T16 0.6154 A20 G1 C35 T15 0.3846 2913 493..576 A26 G6 C45 T5 0.4615 A27 G6 C46 T5 0.3078 A27 G6 C49 T5 0.0769 A27 G6 C50 T5 0.0769 A28 G6 C47 T5 0.0769引物编号1）扩增区域碱基组成多态性
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