陶永萍;尹跃艳;陈旭;卢训;李婷婷;赵声春;游堂贵;丁铭
【摘 要】烟草脉斑病在云南昭通市的烟草上发生危害严重,为明确昭通市烟草脉斑病的病毒种类,本研究采集昭通市的4个烟草种植区症状表现为疑似烟草脉斑病的烟草样品,采用小RNA深度测序技术对不同来源的混合样品进行小RNA测序分析.结果显示混合样品中的病毒分别属于烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus.根据不同病毒属设计通用引物,分别对不同地区的烟草样品进行RT-PCR验证,结果表明,烟草样品中病毒种类有烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒、烟草脉扭病毒和马铃薯Y病毒的pVYN、PVYN-wi和pvyNTN株系. 【期刊名称】《植物保护》
【年(卷),期】2018(044)002
光纤切割刀片【总页数】隔爆型防爆灯6页(P69-74)
【关键词】烟草脉斑病;烟草病毒;小RNA深度测序
焦磷酸盐【作 者】陶永萍;尹跃艳;陈旭;卢训;李婷婷;赵声春;游堂贵;丁铭
【作者单位】酒瓶盖云南省烟草公司昭通市公司,昭通657000;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南省农业生物技术重点实验室,农业部西南农业基因资源与种质创制重点实验室,昆明650223;云南省烟草公司昭通市公司,昭通657000;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南省农业生物技术重点实验室,农业部西南农业基因资源与种质创制重点实验室,昆明650223;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南省农业生物技术重点实验室,农业部西南农业基因资源与种质创制重点实验室,昆明650223;云南省烟草公司昭通市公司,昭通657000;云南省烟草公司昭通市公司,昭通657000;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南省农业生物技术重点实验室,农业部西南农业基因资源与种质创制重点实验室,昆明650223
【正文语种】中 文
【中图分类】S432.41
烟草是云南省的重要农业产业,在全省范围内常年种植面积保持在35万hm2左右。由于烟草
病毒病害常年发生,加之寄主植物和传毒介体周年分布,导致了病毒病原大量积累,烟草病毒病发生危害日益严重。烟草脉斑病在云南昭通烟区发生危害较为普遍,该病自2007年在昭通市小面积发生,2008年发病面积及危害程度大幅增加,目前已成为影响该地区烟草生产最重要的病害之一。烟草脉斑病最早在山东、辽宁、安徽北部和河南西部等地发生危害严重,发病率高达 50%～80%,部分田块甚至绝收[1-4]。该病主要由马铃薯Y病毒Potato virus Y(PVY)侵染引起,常与黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)、烟草蚀纹病毒Tobacco etch virus(TEV)、烟草脉斑驳病毒Tobacco vein mottle virus(TVMV) 、烟草坏死病毒Tobacco necrosis virus(TNV)等病毒中的1个或多个复合侵染烟株[5]。由于该病主要由PVY引起,其症状与病毒种类具有密切的关系,根据侵染烟草的PVY株系可大致将症状分为花叶、脉坏死、条斑及茎坏死[1]。
通过前期调查发现,烟草脉斑病样品中存在多种病毒复合侵染的现象,且在不同地区的复合侵染类型不同,采用传统的血清学、PCR等方法对症状表现明显的烟草病毒病原进行鉴定不能完整地反映样品中的病毒种类,尤其不能检测到可能存在的不同病毒病原。利用基于小RNA深度测序的病毒鉴定技术,不仅能检测到寄主中不同病毒病原,同时具有更高的灵敏度和信噪比。因此本研究在昭通烟区4个不同烟草脉斑病重病区采集典型症状样品,采用小RNA深度
测序技术对烟草脉斑病病样进行检测和分析,为病害的防控提供一定的理论基础。
1 材料与方法
步态识别
1.1 材料
烟草样品采自云南省昭通市苏家院、布嘎、北闸、守望等4个病毒病发生较重的烟区,样品症状主要表现为脉坏死、植株矮化、叶片坏死斑点并伴随有顶部花叶症状,同时提取不同采集地点的烟草样品RNA用于测序结果的验证分析。
1.2 方法
1.2.1 小RNA测序与分析
将4个地点采集的烟草样品按相同质量比例进行混合,混合样品送于华大基因公司进行小RNA测序分析。提取样品总RNA,测定总RNA的浓度及纯度,将质量合格的RNA样品使用NEB针对Illumina测序平台研发的Small RNA建库试剂盒(NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina)及配套的试剂进行小RNA文库构
建。文库构建完成后,使用Agilent2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用Qubit2.0和荧光定量PCR对文库的浓度进行定量,以保证文库质量。对检测合格的小RNA文库在Hiseq 2000测序平台进行测序。使用CLC Genomics Workbench 5软件对获得的小RNA序列数据进行组装和比对分析。
1.2.2 小RNA测序结果验证
根据小RNA测序结果与GenBank中序列比对分析结果,设计合成用于检测烟草脉带花叶病毒Tobacco vein banding mosaic virus(TVBMV)的特异性引物TVBMV-8059F/TVBMV-9382R。根据文献报道分别合成用于扩增烟草花叶病毒属Tobamovirus[6]和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus[7]的通用引物,以及辣椒环斑病毒Chilli ringspot virus(ChiRSV)特异性引物[8],以及用于鉴定PVY不同株系的引物对小RNA测序结果进行验证[9](表1)。
采用Promega公司的Access RT-PCR System 一步法试剂盒进行反转录和PCR扩增,反应体系为50 μL,其中AMV/Tfl 5×Reaction Buffer 10 μL,10 mmol/L dNTP 1 μL,10 μmol/L上游和下游引物各5 μL,25 mmol/L MgSO4 2 μL,AMV Reverse Transcriptase 1 μL,Tfl DNA Polymerase 1 μL,
总RNA 1 μg,补加RNA free水至50 μL。反应条件为45℃反转录45 min;94℃预变性2 min;94℃变性30 s,根据不同引物设定退火温度1 min,68℃延伸2 min,40个循环;68℃延伸7 min。将RT-PCR扩增产物回收并克隆到pEGM-T easy载体上,筛选阳性克隆进行测序。利用DNAMAN Version 7.0进行序列拼接及分析。进化树构建采用了MEGA 6.0软件[10],以NJ(neighbor-joining)方法构建,进化树各分支的可信度用Bootstrap检测(1 000次重复)。
2 结果与分析
2.1 小RNA测序结果
测序结果显示样品中小RNA序列有35 094 242条,分别与GenBank中报道的序列进行对比,结果表明得到的小RNA序列与13种植物病毒核苷酸相似性较高,在93%～100%之间。这13种植物病毒分属烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus,烟草花叶病毒属包括烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus (TMV)、番茄花叶病毒Tomato mosaic virus (ToMV)、辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus (PMMV)、地黄花叶病毒Rehmannia mosaic virus (ReMV);马铃薯Y病毒属包括马铃薯Y病毒Potato virus Y (PVY)、烟草脉带花叶病毒Tobacco vein banding mosaic virus (TVBMV)、
辣椒环斑病毒Chilli ringspot virus(ChiRSV),其中PVY还有PVYO、PVYN、PVYNTN、PVYN-Wi 4个株系;黄症病毒科的马铃薯卷叶病毒属包括甜菜轻型黄化病毒Beet mild yellowing virus (BMYV)、甜菜黄萎病毒Beet chlorosis virus (BChV)、甜菜西黄病毒Beet western yellows virus (BWYV)、芸薹属植物黄化病毒Brassica yellows virus (BrYV)、芜菁黄化病毒Turnip yellows virus (TuYV)、烟草脉扭病毒Tobacco vein distorting virus (TVDV)(表2)。
表1 用于RT-PCR扩增的引物
Table 1 The primers for RT-PCR
天一辉远
引物名称Primername引物序列Primersequence(5′⁃3′)片段大小/kbFragmentlengthTobamo6F6GGAAAAGYGGTGATGTRACWAC0．2[6]Tobamo6R6GAACAGTTTKGCCTCAAAATTCCALu1CCAGTGGTTRTGGTC0．54[7]Lu4GTCTACCTATTTGGTVBMV⁃8059FACTGCGCTTTCGTTGCAAAT1．323TVBMV⁃9382RACGCCACTCACACCAAGTAGChiRSV1fTGGGATAGAGCATCTGAGC0．65[8]ChiRSV1rGAGTCATTTAGGTCATAATCAGTTTPVYc3CAACGCAAAAACACTCA(CT)AAA(AC)GC0．
66[9]PVYfTAAGTG(AG)ACAGACCCTCT(CT)TTCTCPVY3+TGTAACGAAAGGGACTAGTGCAAAG1．11[9]PVY3-CCGCTATGAGTAAGTCCTGCACACP2+CCAGTCAAACCCGAACAAAGG0．53[9]CP1-GGCATAGCGTGCTAAACCCA
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议