两种鯻科鱼类线粒体16S rRNA基因片段序列分析保护架
张龙岗;孟庆磊;安丽;董学飒;付佩胜
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【摘 要】利用PCR技术成功扩增了高体革鯻(Scortum barcoo)和厚唇弱棘喇(Hephaestus fuliginosus)的线粒体16S rRNA基因序列.通过序列测定,得到791 bp的基因片段,碱基A、T、G、C平均含量分别为31.4％、21.2％、20.5％和26.9％,序列中的A+T含量明显高于G+C的含量,这与其他鱼类的16S rRNA基因片段研究结果相一致.通过序列分析发现,高体革鯻和厚唇弱棘喇两序列共存在23处碱基变异,其中碱基转换位点20个,碱基颠换位点3个,转换与颠换比率为6.7,没有发现碱基插入与缺失.与从GenBank中查到的3种蜊科鱼类的同源序列比对,邻接法(neighbor-joining)构建亲缘关系树,结果显示,5种蜊科鱼类聚在一起,分为独立的2支,匀蜊和单匀鯻及花身蜊聚成1支,高体革鯻和厚唇弱棘鯻聚为1支,说明高体革鯻与厚唇弱棘蜊的亲缘关系比较近,而与其他另外3种鯻科鱼类亲缘关系比较远. 【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2011(000)008
【总页数】5页(P148-152)
【关键词】鯻科;线粒体;16S;rRNA;序列分析
【作 者】张龙岗;孟庆磊;安丽;董学飒;付佩胜
【作者单位】山东省淡水水产研究所山东省淡水水产遗传育种重点实验室,济南250117;山东省淡水水产研究所山东省淡水水产遗传育种重点实验室,济南250117;山东省淡水水产研究所山东省淡水水产遗传育种重点实验室,济南250117;山东省淡水水产研究所山东省淡水水产遗传育种重点实验室,济南250117;山东省淡水水产研究所山东省淡水水产遗传育种重点实验室,济南250117 【正文语种】中 文
鱼类线粒体DNA(简称mtDNA)与核DNA相比，具有分子小、编码效率高、拷贝数多、结构简单、进化速度快、不同区域进化速度存在差异以及母性遗传等特点，是一个相对独立的复制单位。目前，随着DNA测序技术和分子信息学的快速发展，mtDNA在鱼类系统学、种间杂交渐渗及分子体遗传学等方面得到广泛应用[1]。
鯻科鱼类(Teraponidae)属硬骨鱼纲(Osteichthyes)，鲈形目(Perciformes)，鲈亚目(Percoidei)，为热带区沿岸性鱼类，全世界计16属约45种，除约10余种为世界性种外，大都属澳洲及新几内亚之淡水种。高体革鯻(S.barcoo)和厚唇弱棘鯻(H.fuliginosus)原产于澳大利亚的淡水水域，它们生长速度快、抗逆性强、肉质细嫩、营养丰富、无肌间刺，是澳大利亚最负盛名的两种淡水鱼。其中厚唇弱棘鯻也是联合国粮农组织继罗非鱼之后向全世界推广的优良品种之一[2]。中国分别于1998年和2001年从澳大利亚引进这两种鱼后开展了一系列的研究，经多年研究，已经从饲养到人工繁殖以及疾病预防等方面取得了许多突破性进展[3－6]。目前关于这两种鯻科鱼类遗传学方面的研究国内仅见张涛[7]及潘德博[8]对于高体革鯻染体核型的研究，关于这两种鱼类线粒体DNA的研究国内尚未见报道。本研究对两种鯻科鱼类的线粒体16S rRNA基因片段进行了PCR扩增和测序，分析比较了两种间的序列差异及其亲缘关系，为新品种的培育提供遗传背景资料，并为其今后的资源保护及其渔业管理提供理论依据。
本研究用高体革鯻和厚唇弱棘鯻样本为山东省淡水水产研究所从澳大利亚引进并繁育的后代，取自山东省淡水水产研究所养殖基地。每个物种取样30尾，活体解剖之后取背部肌肉与－70℃冰箱中保存备用。
1.2.1 总DNA的提取和检测 取新鲜或冷冻样品约100 mg，低温下研磨为糊状，改进的 CTAB法[9]提取总DNA。用灭菌双蒸水溶解，1%琼脂糖电泳检测。纯度较好的DNA模板保存在－20℃冰箱用于PCR扩增。
1.2.2 PCR扩增 参照已报道的鯻科鱼类16S rRNA基因序列进行同源检索排序，设计一对引物。本试验用两条16S rRNA扩增上游引物和反向序列分别为16SR:5'-TCCATAGGGTCTTCTCGTCTT-3'(21 bp);16SF:5'-TGGGAAGAACTTTGAGTAGAG-3'(21 bp)。
用TaKaRa公司的TP650 PCR扩增仪，在50μL反应体系内进行DNA扩增。其内含有4μL(30－50 ng)DNA模板，0.5μmol/L每种引物，0.5 mmol/L 4种 dNTPs，1单位 Taq酶(TaKaRa公司)，2 mmol/L MgCl2以及5μL 10×缓冲液，由超纯水补足50μL。反应程序:94℃预变性2 min;94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸 1 min，35 循环后;72℃延伸5 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳法检测，Marker为DL2000，凝胶成相系统观察、照相。
1.2.3 PCR产物纯化与克隆 PCR产物电泳割胶回收，经BBI公司的EZ-10 Spin Column PCR Product Purification Kit纯化，与 pMD18-T载体(大连宝生物)连接。连接体系总体积
为20μL，其中pMD18-T载体1μL，PCR纯化产物10μL，Ligation solution I9 μL，16℃过夜连接。连接液转化到感受态细胞DH5α中，筛选阳性克隆，液体LB培养基扩大培养，经PCR检测合格后送上海生工测序。
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1.2.4 测序和统计分析 测序仪为ABI 3730基因分析仪，采用双向测序并对测序结果进行人工校对。测得序列通过Clustal X(Version1.83)[10]软件进行多序列比对和分析，clustal格式比对文件采用MEGA3.1[11]软件分析序列的碱基组成。从 Gen-Bank中搜索到鯻科其他3种鱼类:花身鯻(Terapon jarbua)、匀鯻(Leiopotherapon aheneus)和单匀鯻(Leiopotherapon unicolor)的16S rRNA基因片段序列，采用双参数(Kimura 2-parameter)作为距离参数，邻接法(neighbor-joining)构建亲缘关系树。树中各结点的置信度由自引导值(Bootstrap value)估计，重复次数为1 000。
两种鱼类的16S rRNA基因片段经特异性引物PCR扩增后得到了清晰整齐的电泳谱带，分子量大小在750－1 000 bp之间，结果如图1所示。PCR产物经纯化试剂盒纯化，得到了纯度较高的16S rRNA基因片段。片段经载体连接后，阳性克隆率达98%以上。经测序、序列比对拼接，本试验的高体革鯻和厚唇弱棘鯻线粒体16S rRNA基因片段样本共791 bp，两个序列比对结果如图2所示。
序列经Clustal X(Version1.83)对位排序后，得到同源序列长度为791 bp的基因片段，两条序列碱基含量如表1所示。碱基A、T、G、C平均含量分别为31.4%、21.2%、20.5%和26.9%，序列中的A+T含量明显高于G+C含量，这与其他鱼类的16S rRNA基因片段研究结果相一致。高体革鯻和厚唇弱棘鯻两个序列共存在23处碱基变异，即两条序列共存在23个多态位点，其中碱基转换位点为20个，碱基颠换位点为3个，转换与颠换比率为6.7，没有发现碱基插入与缺失。
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从亲缘关系树(图3)可知，5种鯻科鱼类聚在一起，分为独立的2支，匀鯻属的匀鯻和单匀鯻聚在一起，然后又与花身鯻聚成1支。高体革鯻和厚唇弱棘鯻聚为1支，置信度高达100%。
鱼类线粒体DNA是一种共价闭合、环状的双链DNA分子，其结构简单、呈母系遗传、进化速度快及几乎不发生重组等特征已成为分子体遗传学和分子系统学研究的重要标记[12，13]。线粒体基因组内不同的区域进化速度存在差异，适合不同水平的进化研究，其中16S rRNA基因是线粒体基因组中研究较多的基因。该基因近年来在鱼类、虾类、贝类以及蟹类的体遗传结构和系统进化方面有较多的研究[14－17]。线粒体16S rRNA 结构既具有保守
性，又具有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索;高变性则能揭示出生物物种的特征核苷酸序列，是属种鉴定的分子基础，因此一般认为16S rRNA适用于种以上水平的变异分析[18]。
目前未见国内有关高体革鯻和厚唇弱棘鯻16S rRNA序列的报道。本研究采用PCR扩增和测序的方法研究了两种鯻科鱼类的16S rRNA部分序列的差异情况，并比较了它们与鯻科其他3种鱼间的亲缘关系。序列比对结果显示，在所比较的791个位点中，高体革鯻和厚唇弱棘鯻两个序列共存在23处碱基变异，即两条序列共存在23个多态位点，其中碱基转换位点为20个，碱基颠换位点为3个，转换与颠换比率为6.7，没有发现碱基插入与缺失，两个序列同源性高达97%。从亲缘关系树可知，5种鯻科鱼类聚在一起，分为独立的2支，匀鯻属的匀鯻和单匀鯻首先聚在一起，然后又与花身鯻聚成另外的1支，其中匀鯻和单匀鯻置信度为93%。高体革鯻和厚唇弱棘鯻聚为1支，置信度高达100%，说明高体革鯻与厚唇弱棘鯻的亲缘关系比较近，而与其他另外3种鯻科鱼类亲缘关系比较远。这与传统形态分类学结果相一致，该结果提示此序列适合于种间亲缘关系的研究。
高体革鯻和厚唇弱棘鯻由于具有适应性强、食性广、生长速度快、抗逆性强等特点，自引
肩垫进我国后，已成为重要的水产养殖新品种。本研究结果为鯻科鱼类亲缘关系的进一步研究和新品种的培育提供了遗传背景资料，并为其今后的资源保护及渔业管理提供了理论依据。
【相关文献】
[1] 郭新红，刘少军，刘巧，等.鱼类线粒体DNA研究新进展.遗传学报，2004，31(9):983-1000.
[2] Hogan AE，Nicholson JC.Sperm motility of sooty grunter，Hephaestus fuliginosus(Macleay)，and jungle perch，Kuhlia rupestris(Lacépède)in different salinities.Aust J Mar Freshw Res，1987，38(4):523-528.
[3] 宋理平，朱永安，师吉华，等.宝石鲈幼鱼蛋白质需求量的研究.长江大学学报:农学卷，2006(1):165-167.集束线
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