中国计量大学学报Journal of China University of Metrology Vol31No4 Dec2020
第31卷第4期
2020年12月
【文章编号】2096-2835(2020)04-0507-07DOI：10.3969/j.issn.20962835.2020.04.015
中华蜜蜂传粉多样性研究
吴帆，张莉，周晶，常悦，郎一涵，沈叶萍，王靓，李红亮（中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检疫检验重点实验室，浙江杭州310018）
【摘要】目的：研究中华蜜蜂（简称中蜂1pis cera'a cera'a）访花规律和传粉行为与本地开花植物多样性的关系（方法：在2019年3—5月份，采集中国计量大学校园及周边的开花植物花粉，同时搜集校园内饲养中蜂足部携带的蜂花粉，综合利用光学显微镜、扫描电子显微镜、基因扩增和DNA条形码等技术对蜂花粉进行植物源鉴别及含量分析（结果：中蜂能给37种开花植物中的27种进行传粉，且中蜂单次采粉中花粉较为单一，在花期重叠时，中蜂偏向于为花朵形态较大且易采集的植物传粉（基因扩 增可以获得植物源特征目的片段，说明DNA条形码技术可作为花粉鉴定的补充方式（结论：中蜂传粉具有广谱性和多样性，该调查将有利于研究蜜蜂的访花规律以及偏好，为选择蜜蜂进行作物传粉提供理论依据（
【关键词】中华蜜蜂；传粉多样性；蜂花粉；扫描电子显微镜;DNA条形码
【中图分类号】Q96997【文献标志码】A
led电子灯箱控制器Study on Apis eerana eerana pollination diversity based
on bee pollen and DNA barcode
鹿头标本WU Fan,ZHANG Li,ZHOU Jing,CHANG Yue,LANG Yihan,SHEN Yeping,WANG Lang,LI Hongliang (ZhejiangProvincalKeyLaboratoryofBiometrology Inspectionand Quarantine Co l egeof
LifeSciences ChinaJiliang University Hangzhou310018China)
[Abstract]Aims：The research was performed in order to survey the relationship between Apis cera'a ceana(Acc) pollination behavior and flowering plant diversity.Methods:All bee pollen samples were collected from the bee hive reared around China Jiliang Universityfrom Marchto Mayin2019while a l f
lowering plant po l ens werealso co l ectedduringthisperiod Then theco l ectedpo l enswereidentifiedandanalyzedbyusingtheopticalmicroscope the electron microscope and DNA barcode Results：Theresultsshowedthat A/couldpo l inate27of37flowering plants；but one bee usually just collected a single flowering plant at a trip.For plants with the same flowering stage, A/werepartialtopo l inatesomeplantswithlargeande f ortlessco l ectionflowers Thecharacteristicfragmentsof plantscouldbeobtainedbasedongeneamplification indicatingthatDNAbarcodecouldbeusedasasupplementary method for pollen identification.Conclusions:Acc pollination has the wide profile and biodiversity；and the survey will
【收稿日期】2020-10-18《中国计量大学学报》网址：zgjl cbptki
【基金项目】国家自然科学基金项目(No.32000331,31772544)，浙江省自然科学基金项目(No.LQ21C030007)，科技部基础资源调查专项项目(No.2018FY100405)
【通信作者】李红亮#981-)，男，教授，博士，主要研究方向为昆虫嗅觉生理生化与昆虫化学通讯。E-mail：************
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中国计量大学学报
第31卷
help to understand Acc visiting patterns and pollination preferences and will provide theoreticll basis for selecting A cc for agricultural pollination.
[Key words ] Apis cera'a cera'a ; biodiversity of pollination ； bee pollens ; scanning electron microscope;
DNA bar coding
在自然界中，有80%以上的开花植物需要传 粉者为它们授粉，其中大部分的传粉者是昆虫 作为重要的传粉昆虫之一，蜜蜂基于其独特的形
态结构和生物学特性，在植物传粉方面很有优势。 它不仅在维持植物生态系统稳定性和促进生物多 样性方面发挥着重要的作用，而且能提高农作物
和果蔬的产量和品质，具有重要的经济价值和社 会效益23。
我国饲养的蜜蜂达900万，主要有东方蜜 蜂中的亚种中华蜜蜂（中蜂,Api cera'a cera'a $ 和西方蜜蜂的亚种意大利蜜蜂（意蜂,Apis mel-
iifera ligusii c a ），其中中蜂约占三分之一，意蜂
约占三分之二。中蜂是我国的本土蜜蜂，相对于 意蜂，中蜂在长期进化过程中形成了适应山区环
境的特性，在利用零星蜜源、采集能力和利用率上 都有显著的优势「45+。另外，由于我国部分地区中 蜂采用野生和半野生的养殖方式，其抗寒抗病等
能力也较强，这不仅延长了传粉时间，也有利于山 区丘陵等高寒环境下的植物授粉「56+。因此，调查
中蜂传粉植物种类以及规律，有利于人们认知中 蜂在植物生态系统中的重要作用，为后期中蜂的
利用和保护提供理论依据⑺。
近些年，随着设施农业技术的推广和应用，利 用昆虫授粉将有广泛的空间。设施农业在增强农
业综合生产能力、提高市场竞争力和抵抗风险能 力方面具有显著优势8。但是，设施农业种植需 要相对封闭的环境，栽培空间内野生传粉昆虫的
数量极少，这就导致果蔬的坐果率严重不足9。 因此，种植者依靠外界的辅助手段来增加授粉效
率，如人工蘸花和人工喷施生长调节剂等来增加
坐果率［10+。然而，人工授粉方式费时费力，喷施 生长调节剂又会导致果实化学药剂污染。所以，
利用昆虫授粉成为理想的选择，且中蜂在设施农
业授粉中已有应用「11+。但是，目前对中蜂传粉特 性及季节差异性还不十分清楚，如果对中蜂传粉
行为和规律深入调查研究，将有利于未来在设施
农业中应用。综上所述，本研究通过深入了解蜜 蜂对不同植物的传粉习性和规律，既有利于维持
植物生态系统稳定和保护生物多样性，也有利于
帮助农业种植者提高农作物的产量品质及经济效 益，为选择蜜蜂进行作物授粉提供理论依据。
1材料和方法
中华蜜蜂饲养于中国计量大学校园内（北纬
30.32°，东经120. 36°，图1），所有蜂王从育成至
实验开始时均不满1年，具有强劲的产卵能力。 实验中共用3箱中蜂，使用的蜂箱是标准的木质朗 氏活框蜂箱。实验实施时间为2019年3 — 5月。
图1样品采集范围(图示中1的位置，即中国计量大学校园)
Figure 1 Sample collection area(labeled as “1", that is the campus of China Jiliang
课堂教学模式
University)
第4期吴帆等：基于花粉形态及DNA条形码的中华蜜蜂传粉多样性研究509
1.1采集地植物花粉信息库的建立
采集开花植物花粉及建立蜜蜂花粉源信息库。实验期间在中国计量大学及周边(图1)观察、记录植物的开花情况，采集一定量开花植物的花蕊并收集其花粉。将花粉存放于一20C下保存，利用尼康YS100光学显微镜(Nikon,Japan)和日立TM1000电子显微镜(HITACHI,Japan)观察，并通过查《中国木本植物花粉电镜扫描图志》和利用伯乐MyCycler PCR扩增仪(Bio-Rad, USA)扩增等技术初步建立样地植物花粉信息库。
1.2蜂花粉样本采集及光学显微镜观察
在适合时间(天气晴朗、温湿度适中的环境条件下)，每周3〜4次的采集频率，每次早、中、晚各采集一次，捕捉一定量后足携带花粉的采集蜂。将蜂花粉样本在光学显微镜下观察，初步鉴定蜂花粉的形态并估算不同种类的花粉在蜂花粉中的占比，做好实验记录。其余蜂花粉样本置于—20C储存，以备后期电镜观察鉴别使用。
烟气道
1.3蜂花粉样本扫描电子显微镜观察
在日立TM1000扫描电子显微镜(HITA-CHI,Japan)下逐粒观察前期收集的蜂花粉，记录形态并与信息
库做比较，确定每粒蜂花粉中所含花粉的植物源种类。
1.4蜂花粉样本DNA条形码分析
对于电镜观察后无法辨别种类的蜂花粉，我们利用DNA扩增和条形码深入分析。使用生工生物工程股份有限公司(Sangon,China)的Ezup 柱式植物基因组DNA抽提试剂盒，从100mg蜂花粉样品中提取未知植物源的DNA(提取方法见说明书)设计合适的引物序列，以上述花粉DNA为模板用MyCycler PCR扩增仪(Bio-Rad，USA)进行PCR扩增。PCR反应采用3步法扩增程序：变性、退火和延伸，各自温度和时间为: 94C预变性3min)4C，0s；X C(根据引物设定)，20s)2°C,40s；做35个循环，最后72C延伸10min。将扩增后的序列进行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物送至生工进行测序，最后利用生物信息学分析，确定蜂花粉的种类。
2结果与讨论
2.1采集地植物花粉信息库的建立
实验期间在中国计量大学及周边地区收集开花植物花粉共37种，在采集花粉的同时拍摄植物照片，后期通过查和比对《中国高等植物图鉴》进行鉴定，无法确定的植物再利用电子显微镜观察及查询《中国木本植物花粉电镜扫描图志》以及DNA条形码等技术分析，初步建立样地植物花粉信息库。结
果表明，3—5月学校及周边开花植物包括：紫叶李［Prunus Cerasifera Ehrhar f.］，迎春花LJasminum nudiflorum LindL.，浙江尖叶山茶iCamela cuspidate+，山樱花^Cerasus serrulate(Lindl..G.Don ex London］，垂丝海棠^Malus halliana Koehne］，浙江红山茶］Cameli--a Chekiangoleosa Hu］，多花蔷薇£Rosa muliiflora Thunb..，重瓣榆叶梅lAmygdalus tiloba f. multiplexCBge..Rehd..，紫荆^Cercis chinensis Bunge］，石木留［Punica granalum Linn］，玉兰^Magnolia denudate Desr..，尖萼金丝桃［H—pericum acmosepalum N.Robson］，瓜叶菊£Per~ icalUs hybrida］，暴马丁香［Syringa reticulata (Blume)H Haravar amuQensis(Rupr)J S Pringle］，石楠［Photinia serratifolia(Desfontaines)Kalkman］，鹅掌楸* Liriodendron chinense(Hemsl..Sargent..，贴梗海棠\_Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai C.Lagena-ria Koidz］，月季^Rosa chinensis Jacq..，荷花玉兰_Magnolia grandiflora Linn］长叶木兰^Magnolia paenetalauma Dandy］，金橘［For-tunella margarita(Lour.)Swingle］，三堇［Viola tricolor L..，杏花^Armeniaca vulgaris］，结香［_Edgeworthia chrysantha］，金盏花^Calendula officinalis L..，木绣球［Viburnum maco-cephalum Fort..，琼花［Viburnum macroceph-alum Fort. f.keteleeri(Car.)Rehd..，杜鹃^Rhododendron simsii Planch..，火棘］Pyracan-tha f o rtuneana(Maxim.)Li］，香泡\_Citrus medi-ca］，香樟［Cinnamomim camphora(L..Presl..，七姊妹］Rosa rntliiflora Thunb.var carnea Thory］，棕榈［Trachycarpus fortune(Hook. f..H. Wendl..，女贞］Ligustrum lucidum］，向日葵［Hl--anthus annuus L..，碧冬茄［Petunia hybrida］，金鸡菊［Coreopsis drummondit］(
其中大部分为多年生开花植物，如紫叶李、玉兰、鹅掌楸等乔木和灌木；少部分为学校移栽的一
510中国计量大学学报第31卷
年至两年生的观赏性植物，如三堇、碧冬茄、金盏花等草本植物。
2.2蜂花粉收集及显微镜观察
在蜂箱巢门口等待，抓取足部带花粉的采集蜂，收集花粉。期间共收集23次，平均每次约12粒，共约300粒花粉。观察结果显示，每天收集的蜂花粉约有3〜4种花粉植物源（不同日期有重复收集现象），利用光学显微镜（40X）下观察，初步辨别出不同形态的花粉（图2），共收集了27种蜂花粉。
对普通光学显微镜无法确定植物源的蜂花粉，进一步利用电子显微镜观察，将拍摄的蜂花粉电镜照片与《中国木本植物花粉电镜扫描图志》及样地植物花粉电镜图进行对比，根据花粉形状、大小以及花粉壁的结构和纹饰，最终鉴定出21种植物花粉（图3）o
[-c
a b C d e f g
h i J k1m n
图2光学显微镜下部分蜂花粉
Figure2Picturesofbeepo l ensunderanopticalmicroscope
蜂花粉的植物源依次为％—紫叶李；2—迎春花；3—浙江尖叶山茶；4—山樱花；5—垂丝海棠；6—浙江红山茶；7—多花蔷薇8—重瓣榆叶梅9—紫荆10—石榴11—玉兰；12—尖萼金丝桃；13—瓜叶菊14—暴马丁香；15—石楠；16—鹅掌楸；17—贴梗海棠18—月季19—荷花玉兰；20—长叶木兰；21—金橘
图3本文鉴定的21种蜂花粉电镜照片
Figure3SEM photosof21beepo l enspeciesidentifiedinthisstudy
2.3DNA条形码技术鉴定蜂花粉
经过电子显微镜观察分析后，还有6种蜂花粉未能明确辨别出其花粉源植物的种类，最后通过DNA条形码进行鉴定。使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒，对这些蜂花粉进行DNA提取，结果表明可以成功提取蜂花粉DNA,NanoDrop2000测定提取DNA质量浓度均超过200ng/"L o PCR 扩增使用的引物是由生工公司合成，引物序列如表1
（
第4期吴帆等：基于花粉形态及DNA条形码的中华蜜蜂传粉多样性研究511
表1用于DNA条形码分析的引物序列
Table1Primer sequences for DNA barcode analysis
引物Primer序列（5‘73j
TPtrnH-F CGCGCATGGTGGATTCACAAATC TPpsbA-R GTTATGCATGAACGTAATGCTC rbcL-1F ATGTCACCACAAACAGAAAC
rbcL-724R TCGCATGTACCTGCAGTAGC
本实验选择两组引物用于DNA条形码分析，第一组使用TPtrnH-F.TPpsbA-R分别作为正反引物，第二组使用rbcL1F、rbcL-724R作为正反引物，以上述蜂花粉提取的DNA为模板进行PCR扩增。对扩增后的样品进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果照片如图4O
图4DNA条形码基因扩增电泳图
Figure4Gene amplification result of DNA barcode analysis
根据电泳结果可知，使用rbcL1F、rbcL-724R作为正反引物进行PCR扩增的效果较好琼脂糖凝胶块，用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的条带，送至公司测序°但是，由于送检样品DNA浓度过低，未能测出目的条带序列。
2.4数据统计与分析
根据上述蜂花粉植物源鉴定结果，绘制了蜂花粉植物源分布情况O如图5所示，2019年3月上旬，由于
灌浆剂温度过低（只有5〜12C），学校校园内及周围没有发现中蜂采集花粉的行为°箱内检查发现还有少量蜂粮，说明蜂正常越冬O 3月中下旬，开始观察到中蜂采粉回巢的现象°该时间段内中蜂采集周期最长的为迎春花和浙江尖叶山茶的花粉，整个3月下旬都有采集°除此之外，中蜂对紫叶李、山樱花、浙江红山茶花粉的采集时间也较长，都有一周左右得时间°在3月份，也观察到中蜂采集蚕丝海棠、多花蔷薇、重瓣榆叶梅和紫荆的花粉，但周期很短，只在月底观察到一次°
4月份，中蜂继续采集浙江红山茶、浙江尖叶山茶、山樱花和紫荆花粉，其中浙江红山茶整个4月中蜂都有采集，是实验期间内采集周期最长的植物源，约有40d°相对于3月份，4月份中蜂采集的新花粉源有鹅掌楸、贴梗海棠、月季、荷花玉兰、长叶木兰和金桔，而且都集中在4月下旬，其中鹅掌楸和月季的采集周期较长°此外，中蜂在4月份的采集行为要比3月份更为活跃，这可能与蜂王产卵能力增强有关°因为幼虫发育需要工蜂饲喂蜂王浆，而蜂王浆蛋白的合成来源主要来自于花粉中的蛋白质［12：°研究表明，幼虫哺育能力强的蜂其花粉采集能力也更好［13：°
相对于3,4月份，5月份中蜂的采集活动明显减少，甚至下旬没有观察到采集活动°调查发现，一方面由于学校及周边开花植物源减少，另一方面推测可能由于采集花朵花期较短、花朵闭合蜜蜂难以采集°但是，中蜂采集到了尖萼金丝桃、瓜叶菊、暴马丁香和石楠等几种新植物源的花粉，其中采集尖萼金丝桃是在5月初，米集瓜叶菊、暴马丁香和石楠是在5月中上旬°
碳纤维加热板统计蜜蜂所携花粉植物源所属生物学分类科别（见图6）可知，采集数量排在前五的科分别是木兰科（29%）、蔷薇科（27%）、山茶科（10%）、豆科（8%）和木犀科（7%）°中蜂采集的花粉中属于木兰科的植物有鹅掌楸、荷花玉兰、长叶木兰、玉兰；属于蔷薇科的植物有紫叶李、山樱花、垂丝海棠、多花蔷薇、榆叶梅、贴梗海棠、月季、石楠；属于山茶科的植物有浙江尖叶山茶、浙江红山茶；属于
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