金振口服液呼吸道合胞病毒感染引起咳嗽的作用机制研究 卞文青;富莹雪;许惠琴;甘啸阳;戴国英;沈红胜;吕高虹;沈存思
【摘 要】目的 探讨金振口服液呼吸道合胞病毒感染幼年豚鼠咳嗽的作用及其机制.方法 选取幼年豚鼠,随机分为空白组、模型组、磷酸苯丙哌林组、金振口服液(1.3、2.6 g/kg)组.除空白组外,每鼠用106.29 TCID50mL-1滴度的呼吸道合胞病毒(RSV)溶液滴鼻造模,空白组给予等体积无病毒DMEM溶液,次日起各给药组连续给药7d.第8天用枸橼酸引咳法检测豚鼠5 min内咳嗽次数与咳嗽潜伏期,计数肺泡灌洗液中白细胞总数,ELISA法检测肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、IL-13含量,HE染进行肺组织学检查,免疫组织化学染法检测支气管中神经生长因子(NGF)、P物质(SP)、神经肽受体1(NK-1)的表达,Western blot法检测肺组织中NGF、NK-1的表达.结果 金振口服液能够抑制RSV感染导致的豚鼠咳嗽次数增多,下调肺泡灌洗液中白细胞总数及TNF-α、IL-4、IL-13的含量,改善肺组织的炎性浸润,降低支气管NGF、SP和NK-1及肺组织NGF和SP的表达.结论 金振口服液能改善RSV感染引起的病毒性咳嗽,其机制可能与减少气道炎性反应,降低神经源性介质,调节咳嗽敏感性有关. 【期刊名称】《南京中医药大学学报》
【年(卷),期】2018(034)003
【总页数】5页(P277-281)
【关键词】金振口服液;RSV;咳嗽;神经生长因子;神经源性炎症
【作 者】卞文青;富莹雪;许惠琴;甘啸阳;戴国英;沈红胜;吕高虹;沈存思
【作者单位】南京中医药大学药学院,江苏南京210023;江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏南京210023;江苏省方剂高技术研究重点实验室,江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏南京210023;南京中医药大学药学院,江苏南京210023;江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏南京210023;江苏省方剂高技术研究重点实验室,江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏南京210023;南京中医药大学药学院,江苏南京210023;江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏南京210023;江苏省方剂高技术研究重点实验室,江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏南京210023;南京中医药大学药学院,江苏南京210023;江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏南京210023;南京中医药大学药学院,江苏南京210023;江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏南京210023;南京中
医药大学药学院,江苏南京210023;江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏南京210023;南京中医药大学药学院,江苏南京210023;江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏南京210023;南京中医药大学药学院,江苏南京210023
【正文语种】中 文
【中图分类】聚氨酯生产工艺R285.5
呼吸道合胞病毒(RSV)是引发小儿支气管炎的重要病因[1]，一方面易导致细小的毛细支气管充血、水肿、黏液分泌增多、细胞变性，多种炎症因子的上调可直接兴奋咳嗽感受器；另一方面，RSV感染可促进炎症细胞产生神经生长因子(NGF)，并通过多种机制尤其是神经肽的异常升高，激活突触反射的运动神经，从而介导咳嗽[2-3]。
金振口服液组方由儿科经验方羚羊清肺散改良而成，由平贝母、黄芩、大黄、石膏、人工牛黄、青礞石、甘草、山羊角加工而成，可清热解毒、祛痰止咳，对小儿痰热壅肺所致的发热、咳嗽、咳吐黄痰、咳吐不爽等小儿急性支气管炎、肺炎等疾病有很好的作用。药理实验证实金振口服液体外可显著的抑制RSV[4]，对LPS诱导的急性肺损伤大鼠的细胞
免疫功能有一定的正向调节作用[5]，此外，对氨水致小鼠咳嗽模型中金振口服液也有明显的镇咳作用。据此，本实验采用RSV联合枸橼酸诱导幼年豚鼠支气管炎性咳嗽，观察并探讨金振口服液对感染性咳嗽的镇咳作用及作用机制，为其临床应用提供依据。
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1 材料
1.1 动物
健康幼年雄性豚鼠(3周龄)，体质量180～220 g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，许可证号：SCXK(苏)2012-0008。
1.2 细胞及病毒
人喉癌上皮细胞(Hep-2)、RSV，南京中医药大学儿科研究所提供。
1.3 药品与试剂
金振口服液，江苏康缘药业股份有限公司，批号：160207；磷酸苯丙哌林片，江西制药有限公司，批号：1606171；柠檬酸，成都市科龙化工试机厂，批号：2014022201；DMEM，金量子
Gibco公司，批号：8115424；胎牛血清(FBS)，南美GEMINI；豚鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：11/2016；豚鼠白细胞介素-4(IL-4)ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：11/2016；豚鼠白细胞介素-13(IL-13)ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；批号：11/2016；DAB显试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9033；RIPA裂解液，北京索莱宝科技有限公司，批号：20160518；NGF抗体，批号:GR226375-14，NK-1抗体，批号:GR153718-3，SP抗体，批号:GR202535-3均购自美国Abcam公司。
1.4 仪器
402AI超声雾化器，上海鱼跃医疗设备有限公司；FA2104电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；Synergy HT酶标仪，美国Bio-Tek公司；二氧化碳细胞培养箱，日本SANYO公司；倒置荧光显微镜(Ti型)，日本尼康公司。
2 方法
2.1 RSV的扩增及病毒滴度测定
Hep-2用含10%FBS的DMEM高糖培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞，以5×105 mL-1密度接种于24孔板中，于37 ℃、5% CO2条件下静置培养24 h，待细胞贴壁后加入病毒液(每孔200 μL)，隔15 min摇晃1次。2 h后待病毒吸附完全后，吸弃病毒液，加1 mL 2%DMEM后于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，每日观察有无病变。当病变达75%以上冻融3次，收集病毒液，2 000 r/min离心10 min，取上清液用Reed-Muench法测定病毒感染滴度。测定结果病毒滴度为106.29TCID50 mL-1。
2.2 模型制备及给药
将豚鼠随机分为空白组，模型组，阳性对照组(磷酸苯丙哌林6.4 mg/kg)，金振口服液(1.3, 2.6 g/kg)组，每组10只。水合氯醛麻醉后，模型组及各给药组豚鼠两侧鼻孔分别缓缓滴入75 μL病毒液，空白组豚鼠滴入等量无病毒的DMEM。感染次日各组分别灌胃给药，连续给药7 d，空白组和模型组给予等体积的生理盐水。
2.3 咳嗽潜伏期和咳嗽次数测定
末次给药后1 h，取豚鼠置于密闭观察盒内，用超声雾化器以600 mmHg的恒压，通过玻璃
喷头喷入17.5%柠檬酸溶液雾化气，喷雾1 min，记录豚鼠5 min内咳嗽潜伏期和咳嗽次数。
2.4 肺泡灌洗液(BALF)中白细胞数及炎症因子的测定
豚鼠用水合氯醛麻醉，股动脉放血后打开胸腔，结扎右主支气管后用注射针头插入气管结扎固定。左侧肺给予预冷的PBS进行支气管肺泡灌洗，反复抽推3次，留置1 min后回抽BALF并收集。重复3次，每次2 mL，合并肺泡灌洗液，1 500 r/min低温离心10 min。细胞沉淀物用PBS重悬，取20 μL用细胞计数仪测定白细胞总数。
2.5 Western blot检测肺组织NGF、NK-1蛋白表达
取100 mg肺组织，剪切成细小碎片后加入1 mL裂解液，用匀浆器匀浆后置冰上裂解，12 000 r/min离心10 min，取上清液。BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度一致，蛋白样品加入1/4体积的4×蛋白上样缓冲液，沸水煮沸5 min后-80 ℃保存。蛋白上样后SDS-PAGE凝胶电泳，然后转印至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，一抗4 ℃过夜。次日PBST漂洗4次，加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育2 h，PBST漂洗4次后ECL显。
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2.6 肺组织病理学及免疫组化检测支气管NGF、SP、NK-1的蛋白表达
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取右上中叶肺组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，切片，HE染后光镜观察肺组织病理学改变。另取切片，脱蜡水化，置于EDTA缓冲液中微波修复，自然冷却后PBS洗3次，于过氧化氢溶液中避光孵育10 min，PBS漂洗后加入5% BSA封闭20 min，去除BSA液，每张切片加入约50 μL稀释的一抗NGF(1∶100)、SP(1∶100)、NK-1(1∶100)，4 ℃孵育过夜。次日，PBS漂洗切片后，滴加HRP标记的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育50 min，PBS漂洗，DAB显，加入苏木素后流水反蓝，脱水，干燥，透明，封片后于显微镜下观察支气管NGF、SP、NK-1的蛋白表达情况。
2.7 统计学方法
实验结果使用Graph Pad Prism 6软件进行统计分析，数据以±s表示，采用One-Way ANOVA统计方法进行方差分析。图片数据采用Image J进行灰度值的计算，免疫组织化学图片数据应用Image Pro Plus软件进行平均光密度的计算。
3 结果
3.1 对一般状况的影响
造模后，与空白豚鼠相比，RSV感染组豚鼠表现出不同程度的精神不振，咳嗽、痰鸣、饮食减少等表现，少量豚鼠由于体质较弱死亡，各组的死亡情况分别是：模型组2只，磷酸苯丙哌林组3只，金振口服液低剂量组1只，金振口服液高剂量组2只。进入给药阶段后，金振口服液高低剂量组豚鼠精神状况好转，饮食量增加。
3.2 对咳嗽潜伏期及咳嗽次数的影响
在用枸橼酸诱发后，RSV感染豚鼠的咳嗽潜伏期及5 min内咳嗽次数如表1所示。结果显示金振口服液高、低剂量组对咳嗽潜伏期未见明显影响，但能明显减少咳嗽次数，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。
表1 金振口服液对RSV感染豚鼠咳嗽潜伏期及咳嗽次数的影响±s)组别剂量/(g·kg-1)n潜伏期/s5min咳嗽次数咳嗽抑制率/%空白组-1044.0±29.216.8±8.2-模型组-840.6±26.627.0±9.2##-磷酸苯丙哌林组0.0064764.8±33.511.3±6.6**58.1金振口服液低剂量组1.3942.6±24.116.8±7.7*40.4金振口服液高剂量组2.6841.5±25.515.6±7.0*42.2
光滑塞规
注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
3.3 对BALF中白细胞总数的影响
肺泡灌洗液白细胞计数如表2所示。结果显示，与空白组比较，模型组白细胞总数显著增加(P<0.01)，与模型组比较，金振口服液高、低剂量组均能使白细胞总数显著降低。
3.4 对BALF中IL-4、TNF-α、IL-13的含量的影响
肺泡灌洗液中细胞因子的含量如图1所示。结果显示，与空白组比较，模型组BALF中炎症介质含量显著增加(P<0.01)，与模型组比较，金振口服液高、低剂量组均能使IL-4、TNF-α、IL-13在豚鼠BALF中的表达量降低(P<0.05～0.01)。
表2 金振口服液对RSV感染豚鼠BALF中白细胞总数的影响±s)组别剂量/(g·kg-1)n白细胞总数/(×105mL-1)空白组105.92±2.10模型组812.41±2.15##磷酸苯丙哌林组0.006479.46±1.50**金振口服液低剂量组1.397.03±1.83**金振口服液高剂量组2.686.34±1.62**
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