寄生虫与医学昆虫学报
Acta Parasitol. Med. Entomol. Sin.
第 27 卷第 4 期
2020年12月
Vol. 27, No. 4
Dec., 2020
doi ：10. 3969/j.issn.1005-0507. 2020. 04. 003
*收稿日期：2020-05-07
*基金项目：国家自然科学基金面上项目( 81472932)；江苏省自然科学基金(BK20170998 )；国家科技重大专项子课题 (2018ZX10713003、2017ZX10303401)；军队后勤重大项目(AWW16J020)
** 通信作者:E-mail ：张锦海 ahoi@ 163 ；操敏 anniecao2001@ 163
高豹1吕 恒2周东明2胡丹2韩一芳2蔡旭燊1
陆云军1卢一辰1张锦海2**熊晓辉1操敏
(1.南京工业大学食品与轻工学院；江苏南京211816； 2.东部战区疾病预防控制中心，江苏南京210002)
摘要 为制备恙虫病东方体SJ 2株基因重组抗原和恙虫病血清学诊断备选抗原，根据恙虫病东方体56 kDa
外膜蛋白基因序列设计特异性引物，经PCR 扩增东方体SJ 2株56 kDa 型蛋白羧基端部分基因，序列测定并 用软件Bioedit 与我国主要东方体流行株56kDa 蛋白进行氨基酸序列比对分析。然后克隆至载体pET-28a 并
在BL21菌体中诱导表达，通过His 镍柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE 和Western-blot 鉴定分析。结果显示， 成功扩增出恙虫病东方体SJ 2株56 kDa 蛋白708 bp 基因片段，氨基酸序列比对显示，该截短蛋白含2个保
守区和1个可变区。经IPTG 诱导表达后，蛋白电泳在27 kDa 处出现明显目标条带。Western-blot 结果显示， 该蛋白与恙虫病病人血清有特异性免疫反应，与正常人血清不反应。结果表明，诱导表达的重组56 kDa 蛋 白具有良好的免疫原性，可能备选为恙虫病诊断抗原用于恙虫病血清学检测。
关键词 恙虫病东方体； 克隆表达； 免疫分析； 诊断
恙虫病 (tsutsugamushi disease ) 是由恙虫病 东方体Orientia tsutsugamushi 人引起的自然疫
源性疾病，在我国流行历史悠久。近年来随着砍绝对值角度编码器
伐森林、兴修水利、筑路、旅游、驻训等野外作 业行为的增多，人与自然疫源地的接触越来越
密切，从而导致病例不断增多，恙虫病已成为我
国不容忽视的公共卫生问题(Lu et al. , 2010；操
敏等，2011)。迄今为止，我国已有22个省区报 道该病的流行。由于该病的临床症状与许多发热
性疾病的临床症状相似，易引起误诊，因此，恙
虫病的早期诊断尤为重要。
恙虫病东方体56 kDa 是主要的外膜蛋白之
一，已证实为良好的诊断抗原(Stover et al., 1990)。我国恙虫病疫区分布广泛，不同疫区可
能存在多种不同型别的东方体， 且存在异型抗原
抗体不发生结合反应或反应弱的现象(Kelly et al., 2009； Park et al. , 2010)，因此制备多种型
别的恙虫病东方体抗原，以多种抗原混合作为诊 断抗原，有利于提咼诊断方法的敏感性，扩大检 测谱。本研究选用我国东方体新型分离株SJ 2株 (Cao et al.， 2016) 为靶抗原， 克隆表达了该株 56 kDa 截短蛋白基因片段。重组蛋白通过聚丙
烯酰胺凝胶电泳进行鉴定，活性通过蛋白印迹法 进行分析，为进一步建立诊断方法提供备选诊断 抗原。
1材料与方法
1.1毒株
在L929细胞中传代保存的恙虫病东方体SJ 2
株，来源于安徽省三界地区黑线姬鼠体表临淮岗 纤恙螨感染小白鼠获得的恙虫病东方体分离株。
1.2试剂
引物由南京赛百胜生物公司合成；ExTaq 、
dNTP 、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶Bam H I 、EcoRl 均购自大连宝生物工程公司，DNA
Marker 和蛋白 Marker 购自 Fermentas 公司，PCR
割胶回收试剂盒购自Promega 公司，IPTG 购自
・213・
寄生虫与医学昆虫学报第27卷第4期
南京生兴生物公司，PCR试剂盒购自TAKARA 公司，Ni-NTA Agarose、DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒购自QIAGEN公司，质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.3DNA提取与目的片段PCR扩增
采用DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒从感染恙虫病东方体SJ2株的L929细胞中提取DNA O 引物序列：上游引物5'-GGGGATCCCTTAATAGT GCATCTGTCGAA-3'；下游弓I物：5'-CGCGAATT CCTAGAAGTTATAGCGTAC-3'引物由生工生物（上海）股份有限公司提供。以提取的恙虫病东方体DNA为模板，采用50pL反应体系进行目的片段PCR扩增：10xTaq0.5pL,buffer12.5 pL；上下游引物各1pL,DNA模板2pL，补加dd^O至50pL o采用以下步骤进行PCR循环：预变性：95°C5min，然后94C40s,50C60 s,72C60s，共36个循环，最后72C延伸10 min,PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.4序列测定及分析
扩增目的基因片段送至英俊公司测序。序列采用软件Bioedit与我国主要东万体流行株56 kDa蛋白进行氨基酸序列比对分析。
1.5重组表达载体的构建和鉴定
PCR产物和pET-28a用BamH I和EcoR I 限制性内切酶进行双酶切，用Promega公司的PCR割胶回收试剂盒对目的DNA进行回收，定量后用T4DNA连接酶进行连接，并转化感受态细胞DH5a，挑取卡那霉素LB固体培养基平板上的菌落，放入含有卡那霉素LB液体培养基中培养过夜，进行PCR验证，PCR扩增条件同1.3。
1.6重组蛋白在大肠杆菌中的表达
使用质粒小提试剂盒提取鉴定后的阳性克隆质粒，通过热激法将阳性质粒转化到感受态细胞BL21中。挑取单菌落于LB培养基内，37C振荡培养过夜；将菌液按1:100接种于含有卡那霉素的新鲜LB培养液中，37C160r/min振荡培养4h后，力口IPTG至终浓度为0.1mmol/L, 37C诱导培养4.5h；取1.5mL菌液离心后，加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液，置沸水浴中10min。取制备好的样本10pL进行SDS-PAGE 电泳分析。
1.7重组蛋白的纯化
大量诱导表达目标菌液，离心收集沉淀，用・214・8mol/L尿素裂解沉淀，离心取上清液过QIAGEN Ni-NTA Agarose，用5倍柱体积洗涤液清洗镍柱2~3次，最后用洗脱液洗脱镍柱上的蛋白。取10pL纯化后样本进行SDS-PAGE电泳分析。
1.8免疫印迹分析
将胶上蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，恒流120mA转移90min。封闭液选用5%的脱脂奶粉，室温封闭60min。一抗选用3份病人血清混合为1份作为阳性血清，3份正常人血清混合为1份作为正常人对照血清，病人血清和正常人血清各一份按照1:3000进行稀释，室温孵育2h；二抗选用HRP标记的山羊抗人IgG按照1:4000进行稀释，室温孵育2h，最后加入染剂避光反应5~10min。
2结果
2.1目的片段的PCR鉴定
成功从样本DNA中扩增出约708bp的特异性抗原基因（图1）。
图1目的基因片段PCR扩增
Fig.1PCR amplification of objective gene
1：DNA分子量标准DL10000；2：阴性对照；3-5：阳性基因.
1：DNA marker DL10000；2：Negative control；
3-5：Positive gene.
2.2基因测序及序列比对分析
将扩增的基因片段送至英俊公司测序，序列递交GenBank获得序列号为KM115577.1。用Bioedit软件推导成氨基酸序列并进行序列比对分析（图2）。
2.3重组表达质粒PCR鉴定及双酶切鉴定
将PCR产物与pET-28a连接，转入已制备好的DH5a感受态中。从转化平板上挑取单菌落，培养后提取质粒，进行PCR鉴定。
凝胶电
高豹等：安徽三界地区恙虫病东方体SJ 2株基因重组抗原的制备及活性分析
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图2东方体SJ 2株56 kDa 截短蛋白（sj-short ）与国内主要流行株序列比对图
Fig. 2 Alignment of deduced amino acid sequences of 56 kDa homologues of six strains of Orientia挤压爆破
tsutsugamushi
sj-short ： KM115577. 1； Karp ： M33004； Kuroki ： M63380； Kato ： M63382； Kawasaki ： M63383； Gilliam ：
M33267； Young worl ： AF430141. 1.
泳结果显示，在1〜3号样品PCR 鉴定泳道均出 现一条大小约708 bp 的特异条带，与预期大小
一致。（图略）o 进一步用Bam H I 和EcoR I 进
行双酶切验证。凝胶电泳结果显示（图3），在
鉴定泳道5. 6 kb 和708 bp 处分别出现特异条带, 与预期大小一致，表明成功地构建了重组表达质
粒。
2.4重组蛋白的表达和纯化
对诱导表达的重组菌体进行SDS-PAGE 分
析，蛋白凝胶电泳图显示，在约为27 kDa 处出 现一条明显的表达条带，同预期的目标蛋白的大 小一致，表明56 kDa 蛋白基因在原核系统内得
到了融合表达。收集从镍柱上洗脱的重组蛋白,
每管取10 iL 样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结 果显示重组蛋白获得单一的条带，条带大小约为
27 kDa （图 4）o
2.5重组蛋白的抗原性鉴定
恙虫病东方体56 kDa 型特异性基因工程蛋
白抗原经SDS-PAGE 电泳转膜后，以恙虫病东方
体感染的病人多抗血清为抗体（正常人血清为
对照）进行Western blot 反应，结果显示该多抗
ofp002血清能够特异性识别恙虫病东方体56 kDa 型特
・215
・
寄生虫与医学昆虫学报第27卷第4期12
{-----708bp
图3重组表达质粒双酶切鉴定
Fig.3Recombinant expression plasmid
double digestion identification
1:DNA分子量标准DL10000；2：重组双酶切质粒.
1:DNA marker DL10000；2:Double digested
recombinant plasmid.
伯努利方程实验图4重组蛋白的表达和纯化
Fig.4Recombinant protein expression and purification 1：蛋白标准条带25-150kDa；2-3：阴性对照；
4：重组蛋白；5：纯化蛋白.
1:Protein Marker25-150kDa；2-3:Negative control；
4：Recombinant protein；5：Purified protein.
异性重组抗原蛋白(图5)
图5重组蛋白的抗原性鉴定
Fig.5Antigenicity identification of recombinant protein 1,3：蛋白标准条带25-150kDa；2：阴性血清；4：阳性血清.
1,3:Protein Marker25-150kDa；2:Negative
serum；4：Positive serum.3讨论
恙虫病是一种自然疫源性疾病，病原体是恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)，通过恙螨幼虫叮咬传播。恙虫病诊疗重点在于及早明确诊断，临床上应用较为广泛的是免疫学诊断方法，需要进行抗原的制备。过去常用鸡胚培养、细胞培养等方式获得抗原，但操作步骤繁琐、培养周期长、产量低(操敏等，2003)。近年来随着分子生物学技术的发展，越来越多的重组抗原取代天然抗原作为诊断抗原，达到了经济、方便的目的。
恙虫病东方体56kDa蛋白，包括4个保守区和4个可变区，保守区在同型抗体反应中起重要作用，而可变区在异型抗体反应中起作用(Ohashi et al.,1992)，国内外多针对该抗原研制诊断抗原(Stover et al.,1990；Cao et al., 2007)。我国存在恙虫病的不同疫区，存在多种不同东方体型别。安徽省三界地区是恙虫病的新疫区，2007年11月进驻三界的训练部队发生恙虫病暴发流行。恙虫病东方体SJ2株是本课题组前期在安徽三界地区黑线姬鼠体表临淮岗纤恙螨中首次分离到的，与韩国young-worl株亲缘性高(Cao et al.,2016)。本研究克隆表达了恙虫病东方体SJ2分离株56kDa截短蛋白约708bp基因片段，
包括2个保守区和1个可变区，推测可与同型及异型抗体均发生反应。重组蛋白可被恙虫病病人血清识别，与正常人血清不发生反应，表明重组蛋白具有良好的免疫反应活性，可作为诊断抗原，或与其他恙虫病东方体型别重组抗原混合，用于恙虫病诊断试剂的研制。
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・共享资料
高豹等：安徽三界地区恙虫病东方体SJ2株基因重组抗原的制备及活性分析
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CLONING,EXPRESSION AND IMMUNOLOGICAL ACTIVITY
ANALYSIS OF RECOMBINANT PROTEIN OF ORIENTIA
TSUTSUGAMUSHI SJ2IN SANJIE AREA OF ANHUI PROVINCE
GAO Bao1LYU Heng2ZHOU Dong-Ming2HU Dan2HAN Yi-Fang2CAI Xu-Shen1 LU Yun-Jun1LU Yi-Chen1ZHANG Jin-Hai1*XIONG Xiao-Hui1CAO Min1，2*
(1.College Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing211816,Jiangsu,China；
2.Center for Disease Control and Prevention of Eastern Theater Command,Nanjing210002,Jiangsu,China)
Abstract For preparing the gene recombinant antigen of Orientia tsutsugamushi(R.tsutsugamushi)SJ strain,and further development of serological diagnostic reagent for tsutsugamushi disease,the specific primers were designed on the basis of the56kDa outer membrane protein gene sequence of R.tsutsugamushi,the carboxyl terminal partial gene of56kDa protein was amplified by PCR,sequencing and then compared using Bioedit software with the main R.tsutsugamushi epidemic strain in China.The amplified gene fragment of56kDa protein was cloned into pET-28a vect
or,then induced and expressed li BL21.The target protein was purified by His nickel column and identified by SDS-PAGE and Western-blot.As a result,a gene fragment of708bp was successfully amplified,and the deduced amino acid sequence alignment showed that the truncated protein contains2conserve region and1variable region.After IPTG induced expression,a significant band at 27kDa protein emerged,proving the recombinant expression was successful.The results of Western-blot showed that the protein can react with the serum of patient with scrub typhus,but has no reaction with the normal human serum.The recombinant56kDa protein has good immunogenicity and can be used as a candidate of diagnostic antigen for the diagnosis of scrub typhus.
Key words Orientia tsutsugamushi；Cloning and expression；Immunoassay；Diagnosis
Corresponding authors
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