甘蓝S-位点基因SRK、SLG和SP11SCR密码子偏好性分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(5): 1152 1168 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail:***************

本研究由国家自然科学基金项目(31572127)和中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2020D024)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31572127) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2020D024).

通信作者(Corresponding author): 朱利泉,E-mail:***************** **

同等贡献(Contributed equally to this work)

第一作者: 张以忠,E-mail:****************

Received (收稿日期): 2021-01-11; Accepted (接受日期): 2021-09-09; Published online (网络出版日期): 2021-10-18. URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20211018.1156.002.html

DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14003

甘蓝S-位点基因SRK 、SLG 和SP11/SCR 密码子偏好性分析

张以忠1,2,** 曾文艺1,** 邓琳琼2 张贺翠1 刘倩莹1 左同鸿1 谢琴琴1 燈胡科1 袁崇墨1 廉小平1 朱利泉1,*

西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400715; 2

贵州工程应用技术学院生态工程学院, 贵州毕节 551700

摘要: S 位点是芸薹属植物自交不亲和反应的关键位点, 控制自交不亲和反应的识别与启动。为明确甘蓝S 位点基因SRK 和SLG 的S 域和SP11/SC R 编码序列密码子的使用特性, 利用Codon W 、SPSS 软件、Python 程序和EMBOSS 在线程序分析甘蓝41个SRK 、36个SLG 和11个SP11/SCR 等位基因的偏好性, 同时通过中性绘图、ENC-GC3绘图、PR2绘图及多元统计分析探讨基因密码子偏好性形成原因, 并利用不同方法对其进行聚类分析。结果表明, 甘蓝SRK 、SLG 和SP11/SCR 基因编码序列富含A/T, 密码子偏好以A/T 碱基结尾, 偏好性较低。自然选择是影响密码子使用模式的主要因素, 突变压力为次要因素, 还受到二核苷酸丰度的影响。根据RSCU 值发现, SRK 和SLG 基因高表现密码子有4个, SP11/SCR 基因有11个。基于RSCU 的聚类能够较准确地反应甘蓝SRK 、SLG 和SP11/SCR 等位

基因间的关系, 并与基于CDS 核酸序列的聚类具有一致性和可靠性。根据密码子使用偏好性和聚类关系发现, SRK 的S 域和SP11/SCR 编码序列在密码子偏好性上可能是协同进化的。这为更好理解甘蓝中密码子的分布机制和SRK 、SLG 和SP11/SCR 基因的进化提供新内容。

关键词: 甘蓝; 自交不亲和; S-位点基因; 密码子使用偏好; 聚类分析

Codon usage bias analysis of S-locus genes SRK , SLG , and SP11/SCR in Brassica oleracea

ZHANG Yi-Zhong 1,2,**, ZENG Wen-Yi 1,**, DENG Lin-Qiong 2, ZHANG He-Cui 1, LIU Qian-Ying 1, ZUO Tong-Hong 1, XIE Qin-Qin 1, HU Deng-Ke 1, YUAN Chong-Mo 1, LIAN Xiao-Ping 1, and ZHU Li-Quan 1,*

College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2 Ecological Engineering School, Guizhou University of

Engineering Science, Bijie 551700, Guizhou, China

Abstract: S-locus is the key locus in Brassica that controls the recognition and initiation of the self-inc

ompatibility response. To clarify the codon usage characteristics of the S domain of S-locus genes SRK and SLG as well as of SP11/SCR coding sequence in Brassica oleracea , the codon usage bias of 41, 36, and 11 alleles of SRK , SLG , and SP11/SCR were analyzed by Codon W, SPSS, Python, and EMBOSS online tools, respectively. Neutrality, ENC-GC3, and Parity Rule 2 (PR2) plotting together with multivari-ate statistical analysis were also used for the exploration of possible factors that might affect the formation of the codon usage bias of these genes. The cluster analysis performed using various methods showed that S domains of SRK , SLG , and SP11/SCR genes of Brassica oleracea were rich in AT base pairs, the codon preference ended with A/T base and had a lower codon usage bias, which were affected by the natural selection (a main factor) and the mutational pressure (a secondary factor) as well as dinucleo-tide abundance. Based on the RSCU values, 4 over-expressed codons of SRK and SLG , and 11 over-expressed codons of SP11/SCR were identified. Cluster analysis based on RSCU could accurately reflect the relationship among SRK , SLG , and SP11/SCR alleles in Brassica oleracea , which was consistent and reliable with CDS sequence clustering. According to codon us-age bias and cluster relationship, the S domain of SRK and the SP11/SCR coding sequence might be coevolutionary in the codon

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第5期张以忠等: 甘蓝S-位点基因SRK、SLG和SP11/SCR密码子偏好性分析 1153 usage bias. This study enhances our understanding of the mechanism of distribution of codons and the evolution of SRK, SLG, and SP11/SCR genes in Brasscia oleracea.

Keywords:Brassica oleracea; self-incompatibility; S-locus genes; codon usage bias; cluster analysis

遗传密码子是生命信息的基本遗传单位, 是连接DNA和蛋白质的重要桥梁, 每种氨基酸可由1~6个密码子编码, 这些不同密码子称为同义密码子[1-3]。同义密码子的使用具有非随机性, 不同生物甚至同一基因组不同基因对特定密码子的使用都存在差异, 这种现象称为密码子使用偏好性[4-7]。密码子偏好性的形成是一个长期过程, 也是一种常见现象, 从原核到真核生物以及病毒等物种中均存在[8-10]。其使用模式受突变压力、自然选择、碱基组成、蛋白质二级结构等因素的影响[11-14]。密码子偏好性分析对物种的进化发展[15-16]、同义密码子使用偏好性相关机制[17]、转录和翻译进程中的调控机制[18-20]及基因特定功能的理解等方面[21-22]均具有重要意义。

甘蓝(Brassica oleracea)属于十字花科芸薹属植物, 其自交不亲和性(self-incompatibility, SI)由S 位点紧密连锁的花粉决定基因SP11 (S位点蛋白11)/SCR (S位点富含半胱氨酸)[23-24]和雌蕊决定基因SRK (S位点受体激酶)[25-26]特异性识别和启动, S位点糖蛋白(SLG)与SRK的S域氨基酸序列具有很高的相似性[27-28], 在自交不亲和反应中起辅助作用, 能够增加SI的强度[29-30], 但还存在一定的争议[31-32]。

一组SRK、SLG和SP11/ SCR等位基因, 称为S单倍型, S单倍型根据SLG与SRK等位基因核苷酸序列同源性, 分为类型I单倍型和类型II单倍型[33]。以前的研究发现, 类型I单倍型和类型II 单倍型在进化方面差异明显及SRK、SLG和SP11/ SCR基因是协同进化的[34-36]。随着甘蓝SRK、SLG 和SP11/SCR等位基因序列的发表, 使深入研究其密码子的使用模式成为可能。因此, 本研究一方面从基因密码子利用入手, 利用多元统计分析方法首次探讨甘蓝S位点核心区基因SRK、SP11/SCR和SLG密码子使用模式及影响因素。另一方面, 以基因核酸序列的系统发育树为参考, 利用相对同义密码子使用度(relative synonymous codon usage, RSCU)进行系统聚类, 同时结合其密码子的使用模式及影响因素探讨甘蓝S位点核心区基因SRK、SLG和SP11/SCR的进化模式, 以期能更好地理解甘蓝中密码子的分布机制, 为深入研究芸薹属植物自交不亲和调控的分子机制和改善芸薹属植物育种奠定理论基础。

1材料与方法

1.1序列资料

甘蓝41个SRK等位基因、36个SLG等位基因和11个SP11/SCR等位基因来自NCBI (www. ncbi.v/) (表1)。

表1甘蓝SRK、SLG和SP11/SCR等位基因信息

Table 1 Information of SRK, SLG, and SP11/SCR alleles in Brassica oleracea

序号No.

基因登录号

Gene accession

基因名称

Gene name

类型

Class

参考文献

Reference

序号

No.

基因登录号

Gene accession

基因名称

Gene name

类型

Class

参考文献

Reference

1 AB054706.1 SRK1 I Sato et al., 200

2 45X55275.1 SLG1

3 I Dwyer et al., 1991

2 AB054709.1 SRK11 I Sato et al., 2002 46D85228.1 SLG14 I Kusaba et al., 1997

3 AB180901.1 SRK12 I Fujimoto et al., 200647D85202.1 SLG16 I Kusaba et al., 1997

4 AB024420.2 SRK13 I Kusaba et al., 2000 48AB054728.1SLG20 I Sato et al., 2002

5 AB298891.1 SRK14 I Takuno et al., 2007 49AB013719.1SLG23 I Kusaba et al., 1999

6 AB054710.1 SRK16 I Sato et al., 2002 50D85204.1 SLG25 I Kusaba et al., 1997

7 AB054711.1 SRK20 I Sato et al., 2002 51D85205.1 SLG28 I Kusaba et al., 1997

8 AB013720.1 SRK23 I Kusaba et al., 1999 52X16123.1 SLG29 I Trick et al., 1989

9 AB054713.1 SRK25 I Sato et al., 2002 53X79431.1 SLG3 I Delorme et al., 1995

10 AB190355.1 SRK28 I Fujimot,

2004 54D88765.1 SLG32 I Kusaba et al., 1997

11 Z30211.1 SRK29 I Kumar et al., 1994 55AB054730.1SLG33 I Sato et al., 2002

12 X79432.1 SRK3 I Delorme et al., 199556D85206.1 SLG35 I Kusaba et al., 1997

1154作物学报第48卷

(续表1)

序号No.

基因登录号

Gene accession

基因名称

Gene name

类型

Class

参考文献

Reference

序号

No.

基因登录号

Gene accession

基因名称

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Gene name

类型

Class

参考文献

Reference

14 AB054714.1 SRK33 I Sato et al., 2002 58D85207.1 SLG39 I Kusaba et al., 1997

15 AB054715.1 SRK35 I Sato et al., 2002 59AB054732.1SLG45 I Sato et al., 2002

16 AB054716.1 SRK36 I Sato et al., 2002 60AB054733.1SLG50 I Sato et al., 2002

17 AB054718.1 SRK39 I Sato et al., 2002 61D85209.1 SLG51 I Kusaba et al., 1997

18 AB054719.1 SRK45 I Sato et al., 2002 62D85210.1 SLG52 I Kusaba et al., 1997

19 AB054720.1 SRK50 I Sato et al., 2002 63AB054734.1SLG57 I Sato et al., 2002

20 AB054721.1 SRK51 I Sato et al., 2002 64AB054735.1SLG58 I Sato et al., 2002

21 AB298901.1 SRK52 I Takuno et al., 2007 65Y00268.1 SLG6 I Nasrallah et al., 1987

22 AB054722.1 SRK57 I Sato et al., 2002 66AB054736.1SLG62 I Sato et al., 2002

23 AB054723.1 SRK58 I Sato et al., 2002 67D85212.1 SLG64 I Kusaba et al., 1997

24 M76647.1 SRK6 I Stein et al., 1991 68AB054737.1SLG65 I Sato et al., 2002

25 AB054724.1 SRK62 I Sato et al., 2002 69D85199.1 SLG7 I Kusaba et al., 1997

26 AB054725.1 SRK64 I Sato et al., 2002 70AB054727.1SLG8 I Sato et al., 2002

27 AB054726.1 SRK65 I Sato et al., 2002 71D85211.1 SLG63 I Kusaba et al., 1997

28 AB180898.1 SRK7 I Fujimoto et al., 200672D85208.1 SLG46 I Kusaba et al., 1997

29 AB054708.1 SRK8 I Sato et al., 2002 73D85200.1 SLG9 I Kusaba et al., 1997

30 AB054707.1 SRK7b I Sato et al., 2002 74AB054729.1SLG31 I Sato et al., 2002

31 AB032473.1 SRK18 I Suzuki et al., 2000 75D85203.1 SLG17 I Kusaba et al., 1997毛刷制作

32 AB298890.1 SRK4 I Takuno et al., 2007 76D85229.1 SLG22 I Kusaba et al., 1997

33 AB298902.1 SRK61 I Takuno et al., 2007 77AB024415.1SLG2 II Kusaba et al., 2000

34 AB298905.1 SRK68 I Takuno et al., 2007 78AF195626.1BoSCR13 I Schopfer et al., 1999

35 AB054717.1 SRK38 I Sato et al., 2002 79EF577028.1BoSCR13b I Lan et al., 2007

36 AB054712.1 SRK24 I Sato et al., 2002 80AJ278643.1BoSCR3 I Vanoosthuyse et al., 2001

37 AB024422.2 SRK13b I Kusaba et al., 2000 81AB180900.1BoSP11-12I Fujimoto et al., 2006

38 AB180903.1 SRK15 II Fujimoto et al., 200682AB176545.1BoSP11-15II Shiba et al., 2004

39 AB024416.1 SRK2 II Kusaba et al., 2000 83AB067447.1BoSP11-2 II Shiba et al., 2002

40 Y18259.1 SRK5 II Cabrillac et al., 199984AB190356.1BoSP11-28I Fujimoto,

2004

41 AB032474.1 SRK60 I Suzuki et al., 2000 85AB067448.1BoSP11-5 II Shiba et al., 2002

42 D85198.1 SLG1 I Kusaba et al., 1997 86AF195625 BoSCR6 I Schopfer et al., 1999

43 AB326957.1 SLG11 I Takuno et al., 2008 87AB180898.1BoSP11-7 I Fujimoto et al., 2006

44 AB180902.1 SLG12 I Fujimoto et al., 200688AB180904.1BoSP11A-15II Fujimoto et al., 2006

1.2核苷酸组成分析

用Python语言、EMBOSS在线程序和Microsoft Excel软件对SRK、SLG等位基因S域和SP11/SCR 等位基因编码序列进行核苷酸组成分析, 包括整体核苷酸组成(A%、T%、C%和G%)、密码子第3位核苷酸含量(A3%、T3%、C3%和G3%)、整体GC/AT 含量(GC%/AT%)和密码子的第1、第2和第3位的G C/AT含量(G C1%/AT1%、G C2%/AT2%和GC3%/AT3%)以及密码子的第1位和第2位上GC 平均含量(GC12%)。甲硫氨酸密码子AUG和氨酸

密码子UGG只有1个密码子, 终止密码子不编码任

何氨基酸, 因此不纳入分析。

1.3相对同义密码子用法(relative synonymous codon usage, RSCU)分析

RSCU是假定一个特定氨基酸所有密码子使用

相同的情况下, 密码子的观察频率除以期望频率的值, 它是衡量密码子偏好程度的有效指标[37]。第i 个氨基酸的第j个密码子的RSCU值计算公式如下:

第5期

张以忠等: 甘蓝S-位点基因SRK 、SLG 和SP11/SCR 密码子偏好性分析 1155

RSCU 1i

淋幕机ij ij n ij

j x x n ==

∑

式中, X ij 是第i 个氨基酸的第j 个密码子出现次数的实际观察数, n i 是编码第i 个氨基酸的密码子种类数, 其值为2、3、4、6。RSCU>1.0为高频密码子; RSCU<1.0为低频密码子; RSCU =1.0为密码子使用无偏好[37-39]。此外, RSCU>1.6和RSCU<0.6分别为高表现密码子和低表现密码子[40-42]。

1.4 有效密码子数(effective number of codon, ENC )分析

ENC 是衡量同义密码子使用偏好的常用参数, ENC 值的范围从20 (一个氨基酸仅使用一个同义密码子)到61 (同义密码子随机使用)。用Codon W 1.4.2计算ENC, 计算公式如下:

9153ENC 2F F F F =+

2111k

j k n n F n =⎛⎫ ⎪- ⎪⎝⎭=-∑ 式中, (k = 2, 3, 4, 6)表示F k 值的平均值, 对于k 重简

并氨基酸, 式中n j 为相应氨基酸第j 个密码子的出现总数, n 为该氨基酸密码子的出现总数。

ENC 值越接近20, 其密码子偏好性越强, 当ENC 值≤35时, 一个基因有显著的密码子使用偏好[43-44]。

1.5 ENC 绘图(ENC-plot )分析

ENC 绘图是分析各基因密码子使用特征, 探索ENC 和GC3分布的关系, 利用图形展示基因密码子使用偏好性的一种可视化手段, 如果促使密码子使用偏好的唯一因素是突变压力, 则这些点将位于标准曲线上或略低于预期ENC 值的曲线下方。否则, 自然选择等其他因素可能会发挥重要作用。GC3的预期ENC 计算公式如下:

expected 2

ENC 2(1)x x x =+++- 式中, x 表示GC3的值

[43]

。

1.6 对应分析(correspondence analysis, COA )

COA 是一种多元统计方法, 用于检测基因间的密码子使用差异, 揭示影响SRK 、SLG 和SP11/SCR 基因密码子使用模式的主要因素, 基本原理是将59个密码子的RSCU 值(不包括Met 、Trp 和3个终止密码子)绘制在59个轴的多维空间中, 然后识别出

代表基因变异最显著因素的轴[45], 分析软件使用Codon W 1.4.2。根据这些结果, 可以到影响基因密码子使用模式的主要因素。

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1.7 中性绘图分析(neutrality analysis )

以GC12为纵坐标、GC3为横坐标, 绘制中性图, 比较突变压力和自然选择对SRK 、SLG 和SP11/ SCR 密码子使用模式的影响程度。如果GC12与GC3相关性显著, 则回归曲线斜率接近1, 表明密码子3个位置上碱基组成无差异, 密码子使用主要受突变压力的影响; 如果GC12与GC3相关性不显著, 则回归曲线斜率接近0, 说明密码子第1位、2位和第3位碱基组成不同, 密码子使用主要受到选择作用的影响[46-48]。

1.8 PR2-plot 分析

PR2-plot 分析可评估基因密码子第3位点嘧啶和嘌呤的具体使用情况。以[A3/(A3+T3)]为纵坐标、[G3/(G3+C3)]为横坐标, 绘制PR2图。图的中心是垂直轴和水平轴的交点, 坐标为(0.50, 0.50), 即A=T 和G=C 。当密码子均匀分布与中心四周, 说明密码子第3位上碱基使用频率A=T 及G=C, 表明基因在密码子使用上突变压力和自然选择没有偏差[49-51]。

1.9 相对二核苷酸丰度分析

利用Python 语言计算SRK 、SLG 和SP11/SCR 等位基因编码序列二核苷酸相对丰度, 公式如下:

管式反应器xy x y f P f f =

式中, f x 是核苷酸X 的频率, f y 是核苷酸Y 的频率, f x f y 表示二核苷酸XY 的期望频率, f xy 是二核苷酸XY 的观测频率。如果P xy ≥1.23或P xy ≤0.78, 则XY 二核苷酸分别为高表现或低表现二核苷酸[38,52]。

1.10 CDS 和RSCU 的聚类分析

使用SPSS 21.0分析软件, 以每个等位基因作为研究对象, 以59个密码子的RSCU 值为变量, 采用欧氏距离用最短距离法进行系统聚类。通过MEGA7.0软件分别构建基因的系统进化树, 建树方法为邻接法(Neighbor-Joining), 检验方法为自举法(Bootstrap method), 检验次数1000。

2 结果与分析

2.1 甘蓝S -位点基因SRK 、SLG 和SP11/SCR 编码序列富含A 和T 核苷酸

SRK 、SLG 和SP11/SCR 核苷酸组成分析结果见表2。在SRK 中, 核苷酸A 含量(27.47%±0.50%) (平

1156作物学报第48卷

均值±标准差)最高, T (26.84%±0.40%)次之, 略高于

G (25.13%±0.44%), C (20.56%±0.42%)最低。AT

(54.31%±0.47%)高于GC (45.69%±0.47%)。同义密码子第3位核苷酸表现, T3 (30.28%±1.07%)最高, G3 (25.15%±1.07%)次之, 略高于C3 (24.46%±1.12%), A3 (20.11%±0.93%)最低。同义密码子第1、第2、第3位核苷酸组成, GC1 (42.27%±0.87%)、GC2 (45.18%±0.84%)、GC12 (43.72%±0.50%)和GC3 (49.61%±1.39%), 均低于50%。在SLG中, 核苷酸A 含量(27.30%±0.45%)最高, T (26.76%±0.50%)次之, 略高于G (25.23%±0.38%), C (20.72%±0.47%)最低。AT (54.05%±0.51%)高于GC (45.95%±0.51%)。同义密码子第3位核苷酸表现, T3 (30.14%±1.13%) > G3 (25.25%±0.80%) > C3 (24.54%±0.95%) > A3 (20.07%± 0.96%)。同义密码子第1、第2、第3位核苷酸组成, GC1 (42.33%±0.81%)、GC2 (45.72%±0.98%)、GC12 (44.02%±0.58%)和GC3 (49.79%±1.26%), 均低于50%。在SP11/SCR中, T (31.90%±1.93%) > A (29.68%± 1.42%)＞G (21.92%±2.43%) > C (16.49%±1.87%)及T3 (38.59%±4.04%) > A3 (27.79%±3.76%) > G3 (17.15%±3.70%) > C3 (16.47%±3.46%)。AT (61.58%± 2.02%) > GC (38.42%±2.02%)。同义密码子第1、第2、第3位核苷酸组, GC1 (37.32%±3.55%)、GC2 (44.32%±3.86%)、GC12 (40.82%±2.75%)和GC3 (33.61%±2.78%), 均低于50%。表明SRK、SLG及SP11/SCR编码序列富含A/T。

表2SRK、SLG和SP11/SCR编码序列的核苷酸组成和ENC

Table 2 Nucleotide composition and ENC of SRK, SLG, and SP11/SCR coding sequences

基因Gene

核苷酸组成和ENC

Nucleotide composition and ENC SRK SLG

SP11/SCR

A (%) 27.47±0.50 27.30±0.45 29.68±1.42

T (%) 26.84±0.40 26.76±0.50 31.90±1.93

C (%) 20.56±0.42 20.72±0.47 16.49±1.87

G (%) 25.13±0.44 25.23±0.38 21.92±2.43

A3 (%) 20.11±0.93 20.07±0.96 27.79±3.76

T3 (%) 30.28±1.07 30.14±1.13 38.59±4.04

C3 (%) 24.46±1.12 24.54±0.95 16.47±3.46

G3 (%) 25.15±1.07 25.25±0.80 17.15±3.70

GC (%) 45.69±0.47 45.95±0.51 38.42±2.02

AT (%) 54.31±0.47 54.05±0.51 61.58±2.02

GC1 (%) 42.27±0.87 42.33±0.81 37.32±3.55

GC2 (%) 45.18±0.84 45.72±0.98 44.32±3.86

GC3 (%) 49.61±1.39 49.79±1.26 33.61±2.78

GC12 (%) 43.72±0.50 44.02±0.58 40.82±2.75

ENC 56.37±1.20

55.66±1.17

48.55±4.40 ENC: 有效密码子数。ENC: effective number of codons.

2.2A和T结尾的密码子是SRK、SLG和SP11/ SCR编码序列的偏好密码子

RSCU用来分析评价甘蓝SRK、SLG和SP11/SCR 编码序列中同义密码子的使用模式(表3)。在SRK、SLG和SP11/SCR编码序列中, RSCU>1的密码子分别有27、29和26个, 均是A/T结尾密码子多于G/C 结尾密码子, 是甘蓝自交不亲和上游基因的高频密码子。RSCU<1的密码子分别有32、30和33个, 均是G/C结尾密码子多于A/T结尾密码子, 是甘蓝自交不亲和上游基因的低频密码子。密码子高表现(RSCU>1.6)和低表现(RSCU<0.6)分析发现, SRK的27个和SLG的29个高频密码子中均有4个(CUU、GUG、GCU和AGA)的RSCU>1.6, 3个以A/T结尾, 1个以G结尾; 26个SP11/SCR高频密码子中有11个(UUA、UUG、GUU、UCA、CCU、ACU、GCU、CAA、AAU、AGG、GGA)的RSCU>1.6, 9个以A/T 结尾, 2个以G结尾。表明甘蓝自交不亲和上游基因密码子偏好以A/T碱基结尾。

考虑到甘蓝S-位点基因SRK、SLG和SP11/SCR 编码序列富含A和T核苷酸, 上述RSCU分析结果暗示SRK、SLG和SP11/SCR的编码区偏好密码子受核苷酸组成限制的影响(在本研究中为A和T的限制)。

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