原位杂交技术应用于染体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。 多种探针标记检测系统
基于、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。
荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。
间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显。常用的报告分子如，生物素。结合抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间
燃煤烤箱接的底物反应检测。标记核酸的历史可追溯到1987年，由于是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。
通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染体不同区域或细胞样本中不同RNA序列的多重检测。
原位杂交中探针的选择
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DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。
就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。
Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章：A Method for High Quality Digoxigenin-Labeled RNA Probes for In Situ Hybridization
原位杂交检测步骤
原位杂交涉及的步骤 ：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显）检测。
1. 玻片的准备和样品固定
对于染体涂片， 1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，
为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染体涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定剂。 战术防身笔
2. 样品预处理
在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：
内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的甲醛溶液处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液 (pH7.4)
HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 –30 min的处理。染体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5 min。也
有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3. 探针制备
在进行研究前，确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
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焊接钢板4. 原位杂交过程
杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交
液中不含探针和硫酸葡聚糖（见下）。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性 ，染体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃ 10min。
杂交流程
杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较
高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显著影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0
1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%
硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours
对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体 DNA/RNA (1 mg/ml)、探针 (20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours
杂交后的洗涤
杂交后进行非特异结合探针的洗脱，同时也可进行单链核酸链的酶消化。洗脱的严谨性可通过调节洗脱液中的甲酰胺浓度、盐浓度和洗脱温度。常规洗涤条件为含50%甲酰胺的 2×SSC。但在实际的实验中发现，对于提高杂交检测的特异性，严谨的杂交条件比严谨洗涤更为有效。
5. 免疫细胞化学反应 (报告分子标记的探针)
如果使用间接检测的方法，通常需引入免疫细胞化学反应进行酶免反应和底物检测。免疫检测前进行样品的封闭能防止检测时的高背景。如进行生物素标记的探针杂交和检测，在
轻质隔墙条板含Tween 20 和BSA的 PBS中进行封闭。
如进行DIG标记的探针杂交和检测，在含Blocking Reagent的Tris-HCl缓冲液中进行封闭。如果抗原抗体的结合能不受高盐条件影响，检测时加入0.4 M NaCl将有助于防止背景染。封闭后再 进行抗体孵育反应，通常是在保湿容器中进行37°C 30 min孵育 (或室温2h孵育)。抗体结合后在含Tween 20的缓冲液中进行3次5–10 min的洗涤。
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