一种慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因检测试剂盒及其检测方法

一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒及其检测方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学和基因诊断技术领域，具体涉及一种慢性粒细胞白血病融合基因检测用引物探针混合液、检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

2.慢性粒细胞白血病(cml)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，临床上分为慢性期、加速期和急变期，急性变是临床引起死亡的主要原因，细胞遗传学特征是具有ph染体，即t(9；22)(q34；q11)，其分子水平上形成bcr-abl mrna。t(9；22)(q34；q11)为cml特征性染体易位，形成断裂点丛集区-abelson癌基因(bcr—abl)融合p210基因，其中bcr—abl是cml的分子标志，近年国外在分子水平对bcr-abl融合蛋白进行研究发现，根据bcr断裂点位置的不同分为3个主要类型：m-bcr，m-bcr，μ-bcr，相应编码p210蛋白、p190蛋白及p230蛋白，95％以上的cml患者可表达p210蛋白；5％以下的cml患者表达p190蛋白；在急性前b细胞白血病具有bcr-abl融合蛋白阳性的患者中2/3表达为p190蛋白，1/3表达为p210蛋白。p190蛋白及p210蛋白不仅在cml患者中表达，而且也在急性髓系白血病患者中表达。对白血病相关融合基因进行常规检查，不仅可以为白血病诊断、分型、临床选择和预后判断提供重要依据，同时也是白血病微小残留病变(mrd)检测的基础。传统的细胞遗传学和fish已经很难对残留的微小病灶进行检测。因此具有灵敏度高、精确度高且可以对微小病灶进行分子水平检测的聚合酶链式反应(pcr)检测方法，成为对患者初期检测和预后监测检查的重要手段，因此对bcr-abl融合基因的分型和定量检测对慢性粒细胞白血病(cml)的临床诊断和愈后检测意义重大。应用实时定量pcr(rq—pcr)技术检测该基因，能为临床医生提供定量的检测结果，较定性检测有更大的临床应用价值。
3.目前的试剂盒通常采用的是rna直接rt-pcr一步法，具有对rna量的要求高，检测时间长的缺陷，而且2ul骨髓血液标本最多能提取30-50ulrna产物，用目前现有的试剂盒一次使用30ulrna，不能留取多余样本，对于有需要复查的标本，具有无法保证重复检测的技术缺陷。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒及其检测方法。
5.本发明的第一个目的是提供一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒，由以下组分组成：检测试剂盒a、检测试剂盒b和检测试剂盒c；
6.所述检测试剂盒a包含:
7.pcr反应液，pcr反应液的浓度为10umol/l；
8.引物探针混合反应液a，引物探针混合反应液a的浓度为10umol/l；
9.无核酶水，无核酶水的浓度为10umol/l；
10.所述检测试剂盒b包含:
11.pcr反应液，pcr反应液的浓度为10umol/l；
12.引物探针混合反应液b，引物探针混合反应液b的浓度为10umol/l；
13.无核酶水，无核酶水的浓度为10umol/l；
14.所述检测试剂盒c包含:
15.pcr反应液，pcr反应液的浓度为10umol/l；
16.引物探针混合反应液c，引物探针混合反应液c的浓度为10umol/l；
17.无核酶水，无核酶水的浓度为10umol/l。
18.优选的，所述引物探针混合反应液a由以下引物和探针组成：
19.外引物b f：5'-agc att ccg ctg acc atc a-3'；
20.外引物bcr-abl r：5'-act cag acc ctg agg ctc aaa g-3'；
21.外探针bcr-ablp：5'-fam-aag ccc ttc agc ggc cag tag cat-tamra-3'；
22.所述外引物b f、外引物bcr-abl r和外探针bcr-ablp的浓度均为10umol/l。
23.优选的，所述引物探针混合反应液b由以下引物和探针组成：
24.外引物e f：5'-cgc aag acc ggg cag at-3'；
25.外引物bcr-abl r：5'-act cag acc ctg agg ctc aaa g-3'；
26.外探针bcr-ablp：5'-fam-aag ccc ttc agc ggc cag tag cat-tamra-3'；
27.所述外引物e f、外引物bcr-abl r和外探针bcr-ablp的浓度均为10umol/l。
28.优选的，所述引物探针混合反应液c由以下引物和探针组成：
29.内参引物abl f：5'-gat acg aag gga ggg tgt acc a-3'；
30.内参引物abl r：5'-ctc ggc cag ggt gtt gaa-3'；
31.内参探针abl p：5'-fam-tgc ttc tga tgg caa gct cta cgt ctc ct-tamra-3'；
32.所述内参引物abl f、内参引物abl r和内参探针ablp的浓度均为10umol/l。
33.本发明的第二个目的是提供一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的检测方法，包括以下步骤：
34.s1、取骨髓血液标本2ml，提取rna；
35.s2、取2ul的步骤s1提取到的rna，加入8ul的rna逆转录试剂反应得到10ul的cdna模板；
36.s3、分别向检测试剂盒a、检测试剂盒b和检测试剂盒c中加入2ul的步骤s2得到的cdna模板进行pcr扩增反应，反应结束后，检测得到反应结果。
37.优选的，步骤s3中，所述pcr扩增反应的条件为：95℃30秒后，进入主循环95℃变性5s，然后在60℃31秒读取数据，共40个循环。
38.优选的，步骤s3中，所述检测试剂盒a的成分配比为：
39.pcr反应液10.4ul；
40.引物探针混合反应液a，具体为外引物b f0.4ul、外引物bcr/abl r 0.4ul、外探针bcr/ablp 0.8ul；
41.无核酶水6ul。
42.优选的，步骤s3中，所述检测试剂盒b的成分配比为：
43.pcr反应液10.4ul；
44.引物探针混合反应液b，具体为外引物e f0.4ul、外引物bcr/abl r 0.4ul、外探针bcr/ablp 0.8ul；
45.无核酶水6ul。
46.优选的，步骤s3中，所述检测试剂盒c的成分配比为：
47.pcr反应液10.4ul；
48.引物探针混合反应液c，具体为内参引物abl f0.4ul、内参引物abl r 0.4ul、内参探针ablp 0.8ul；
49.无核酶水6ul。
50.本发明与现有技术相比，其有益效果在于：
51.(1)本发明提供的检测试剂盒通过采取两步法进行检测，即样本提取rna后逆转录为cdna后再利用pcr的方法进行定量测定，具有需求rna量少且操作更稳定、重复性更好的优势；
52.(2)本发明通过rna逆转录为cdna的操作，使得产物样本质量稳定，可在-70度低温长期保存，并且产物量大可提供多次复查，可避免二次抽取骨髓的痛苦，克服了现有rna直接rt-pcr一步法对rna要求量大且无法保存产物用以复查的技术缺陷；
53.(3)本发明提供的试剂盒可对bcr-abl p210融合基因和bcr-abl p190融合基因进行检测，反应检测速度快，降低了反应时间，且降低了成本价格。
附图说明
54.图1为本发明实施例1提供的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒的检测反应曲线图；
55.图2为对比例1提供的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒的检测反应曲线图；
56.图3为对比例2提供的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒的检测反应曲线图。
具体实施方式
57.下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
58.以下实施例中所有的引物和探针序列均根据文献chasseriau j，rivet j，bilanf，et al.characterization ofthe different bcr-abltranscripts with a single multiplex rt-pcr[j].j mol diagn，2004，6(4):343－347进行设计。
[0059]
实施例1
[0060]
本发明实施例提供了一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒，具体由以下组分组成：检测试剂盒a、检测试剂盒b和检测试剂盒c，三个试剂盒为相互独立的试剂盒；
[0061]
所述检测试剂盒a包含:
[0062]
pcr反应液，pcr反应液的浓度为10umol/l；
[0063]
引物探针混合反应液a，引物探针混合反应液a的浓度为10umol/l；
[0064]
无核酶水，无核酶水的浓度为10umol/l；
[0065]
引物探针混合反应液a由以下引物和探针组成：
[0066]
外引物b f：5'-agc att ccg ctg acc atc a-3'；
[0067]
外引物bcr-abl r：5'-act cag acc ctg agg ctc aaa g-3'；
[0068]
外探针bcr-ablp：5'-fam-aag ccc ttc agc ggc cag tag cat-tamra-3'；
[0069]
所述外引物b f、外引物bcr-abl r和外探针bcr-ablp的浓度均为10umol/l。
[0070]
所述检测试剂盒b包含:
[0071]
pcr反应液，pcr反应液的浓度为10umol/l；
[0072]
引物探针混合反应液b，引物探针混合反应液b的浓度为10umol/l；
[0073]
无核酶水，无核酶水的浓度为10umol/l；
[0074]
引物探针混合反应液b由以下引物和探针组成：
[0075]
外引物e f：5'-cgc aag acc ggg cag at-3'；
[0076]
外引物bcr-abl r：5'-act cag acc ctg agg ctc aaa g-3'；
[0077]
外探针bcr-ablp：5'-fam-aag ccc ttc agc ggc cag tag cat-tamra-3'；
[0078]
所述外引物e f、外引物bcr-abl r和外探针bcr-ablp的浓度均为10umol/l。
[0079]
所述检测试剂盒c包含:
[0080]
pcr反应液，pcr反应液的浓度为10umol/l；
[0081]
引物探针混合反应液c，引物探针混合反应液c的浓度为10umol/l；
[0082]
无核酶水，无核酶水的浓度为10umol/l。
[0083]
引物探针混合反应液c由以下引物和探针组成：
[0084]
内参引物abl f：5'-gat acg aag gga ggg tgt acc a-3'；
[0085]
内参引物abl r：5'-ctc ggc cag ggt gtt gaa-3'；
[0086]
内参探针abl p：5'-fam-tgc ttc tga tgg caa gct cta cgt ctc ct-tamra-3'；
[0087]
所述内参引物abl f、内参引物abl r和内参探针ablp的浓度均为10umol/l。
[0088]
本发明实施例还提供了一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的检测方法，具体包括以下步骤：
[0089]
s1、取患者骨髓血液标本2ml，提取rna，提取rna的操作具体可采用现有的传统经典的提取方法，也可用核酸全自动提取仪进行提取；
[0090]
s2、取2ul的步骤s1提取到的rna，加入8ul的rna逆转录试剂反应得到10ul的cdna模板，其中rna逆转录试剂来源于大连宝生物公司；
[0091]
s3、分别向检测试剂盒a、检测试剂盒b和检测试剂盒c中加入2ul的步骤s2得到的cdna模板进行pcr扩增反应，反应结束后，通过abi7500荧光定量仪器读取检测得到反应结果数据，pcr扩增反应的条件为：95℃30秒后，进入主循环95℃变性5s，然后在60℃31秒读取数据，共40个循环。
[0092]
具体对bcr-abl p210融合基因和bcr-abl p190融合基因的检测公式如下所示：
[0093]
bcr/abl p210融合基因的相对表达量＝检测试剂盒a的目的基因拷贝数/检测试剂盒c的内参基因的拷贝数
×
100％
[0094]
bcr/abl p190基因的相对表达量＝检测试剂盒b的目的基因拷贝数/检测试剂盒c的内参基因的拷贝数
×
100％
[0095]
检测试剂盒a的成分配比为：
[0096]
pcr反应液10.4ul；
[0097]
引物探针混合反应液a，具体为外引物b f0.4ul、外引物bcr/abl r 0.4ul、外探针bcr/ablp 0.8ul；
[0098]
无核酶水6ul。
[0099]
检测试剂盒b的成分配比为：
[0100]
pcr反应液10.4ul；
[0101]
引物探针混合反应液b，具体为外引物e f0.4ul、外引物bcr/abl r 0.4ul、外探针bcr/ablp 0.8ul；
[0102]
无核酶水6ul。
[0103]
检测试剂盒c的成分配比为：
[0104]
pcr反应液10.4ul；
[0105]
引物探针混合反应液c，具体为内参引物abl f0.4ul、内参引物abl r 0.4ul、内参探针ablp 0.8ul；
[0106]
无核酶水6ul。
[0107]
上述的pcr反应液为自配，50ml的pcr反应液包含：
[0108]
10
×
缓冲液：10ml；
[0109]
mg
2+
：8ml；
[0110]
dntp：1.2ml；
[0111]
taq酶：1.5ml；
[0112]
ung酶：120ul；
[0113]
rox:200ul；
[0114]
ddh2o:28.98ml
[0115]
将上述各组分充分混匀，然后分装为1.25ml/管，超低温-70℃冰箱保存。
[0116]
对比例1
[0117]
本对比例提供了一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒的组成以及慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的检测方法，所提供的检测试剂盒的组成以及检测方法均与实施例1相同，区别仅在于，检测试剂盒a中的pcr反应液、外引物b f、外引物bcr-abl r、外探针bcr-ablp和无核酶水的浓度均为20umol/l，检测试剂盒b中的pcr反应液、外引物e f、外引物bcr-abl r/外探针bcr-ablp和无核酶水的浓度均为20umol/l；检测试剂盒c中的pcr反应液、内参引物abl f、内参引物abl r、内参探针abl p和无核酶水的浓度均为20umol/l。
[0118]
对比例2
[0119]
本对比例提供了一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒的组成以及慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的检测方法，所提供的检测试剂盒的组成以及检测方法均与实施例1相同，区别仅在于，检测试剂盒c的成分配比为：pcr反应液20.4ul、内参引物abl f0.8ul、内参引物abl r 0.8ul、内参探针ablp 1.2ul和无核酶水6ul。
[0120]
下面对本发明实施例1以及对比例1和2提供的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒的检测性能进行研究
[0121]
用已知阳性标本，做梯度稀释4管，然后分别加入到本发明实施例1以及对比例1和2提供的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒中，按照本发明实施例1提供的检测方法进行检测，检测反应曲线分别如图1至图3所示，通过图1至图3的反应曲线可以看出，本发明实施例1提供的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒的检测性能明显优于对比例1和2提供的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒，说明本发明实施例1所提供的检测试剂盒中各组分的浓度以及配比为特殊设定，只有在本发明实施例1所提供的各组分的浓度以及配比情况下得到的检测试剂盒才具有优异的检测性能。
[0122]
综上所述，本发明实施例提供的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒的反应体系配比是特殊设定的，在该反应体系配比下，对于bcr-abl p210融合基因和bcr-abl p190融合基因均具有较好的检测性能，且本发明实施例提供的检测试剂盒通过采取两步法进行检测，即样本提取rna后逆转录为cdna后再利用pcr的方法进行定量测定，具有需求rna量少且操作更稳定、重复性更好的优势；而且通过rna逆转录为cdna的操作，使得产物样本质量稳定，可在-70度低温长期保存，并且产物量大可提供多次复查，可避免二次抽取骨髓的痛苦，克服了现有rna直接rt-pcr一步法对rna要求量大且无法保存产物用以复查的技术缺陷。
[0123]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

技术特征：

1.一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：检测试剂盒a、检测试剂盒b和检测试剂盒c；所述检测试剂盒a包含:pcr反应液，pcr反应液的浓度为10umol/l；引物探针混合反应液a，引物探针混合反应液a的浓度为10umol/l；无核酶水，无核酶水的浓度为10umol/l；所述检测试剂盒b包含:pcr反应液，pcr反应液的浓度为10umol/l；引物探针混合反应液b，引物探针混合反应液b的浓度为10umol/l；无核酶水，无核酶水的浓度为10umol/l；所述检测试剂盒c包含:pcr反应液，pcr反应液的浓度为10umol/l；引物探针混合反应液c，引物探针混合反应液c的浓度为10umol/l；无核酶水，无核酶水的浓度为10umol/l。2.如权利要求1所述的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物探针混合反应液a由以下引物和探针组成：外引物b f：5'-agc att ccg ctg acc atc a-3'；外引物bcr-abl r：5'-act cag acc ctg agg ctc aaa g-3'；外探针bcr-ablp：5'-fam-aag ccc ttc agc ggc cag tag cat-tamra-3'；所述外引物b f、外引物bcr-ablr和外探针bcr-ablp的浓度均为10umol/l。3.如权利要求1所述的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物探针混合反应液b由以下引物和探针组成：外引物e f：5'-cgc aag acc ggg cag at-3'；外引物bcr-abl r：5'-act cag acc ctg agg ctc aaa g-3'；外探针bcr-ablp：5'-fam-aag ccc ttc agc ggc cag tag cat-tamra-3'；所述外引物e f、外引物bcr-ablr和外探针bcr-ablp的浓度均为10umol/l。4.如权利要求1所述的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物探针混合反应液c由以下引物和探针组成：内参引物abl f：5'-gat acg aag gga ggg tgt acc a-3'；内参引物abl r：5'-ctc ggc cag ggt gtt gaa-3'；内参探针abl p：5'-fam-tgc ttc tgatgg caa gct cta cgt ctc ct-tamra-3'；所述内参引物abl f、内参引物abl r和内参探针abl p的浓度均为10umol/l。5.一种慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、取骨髓血液标本2ml，提取rna；s2、取2ul的步骤s1提取到的rna，加入8ul的rna逆转录试剂反应得到10ul的cdna模板；s3、分别向权利要求1中的检测试剂盒a、检测试剂盒b和检测试剂盒c中加入2ul的步骤s2得到的cdna模板进行pcr扩增反应，反应结束后，检测得到反应结果。6.如权利要求5所述的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述pcr扩增反应的条件为：95℃30秒后，进入主循环95℃变性5s，然后在60℃31
秒读取数据，共40个循环。7.如权利要求5所述的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述检测试剂盒a的成分配比为：pcr反应液10.4ul；引物探针混合反应液a，具体为外引物b f0.4ul、外引物bcr/abl r 0.4ul、外探针bcr/ablp 0.8ul；无核酶水6ul。8.如权利要求5所述的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述检测试剂盒b的成分配比为：pcr反应液10.4ul；引物探针混合反应液b，具体为外引物e f0.4ul、外引物bcr/abl r 0.4ul、外探针bcr/ablp 0.8ul；无核酶水6ul。9.如权利要求5所述的慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述检测试剂盒c的成分配比为：pcr反应液10.4ul；引物探针混合反应液c，具体为内参引物abl f 0.4ul、内参引物abl r0.4ul、内参探针ablp 0.8ul；无核酶水6ul。

技术总结

本发明公开了一种慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因检测试剂盒，由以下组分组成：检测试剂盒A、检测试剂盒B和检测试剂盒C；本发明还公开了一种慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因的检测方法，包括以下步骤：S1、取骨髓血液标本2ML，提取RNA；S2、取2UL的步骤S1提取到的RNA，加入8UL的RNA逆转录试剂反应得到10UL的CDNA模板；S3、分别向检测试剂盒A、检测试剂盒B和检测试剂盒C中加入2UL的步骤S2得到的CDNA模板进行PCR扩增反应，反应结束后，检测得到反应结果。本发明提供的检测试剂盒通过采取两步法进行检测，具有需求RNA量少且操作更稳定、重复性更好的优势。更好的优势。更好的优势。