细胞是动植物和人体的基本组成单元，离子通道是细胞与外界以及与细胞内通信的重要手段。离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础。生物电信号通常用电学方法进行测量，因而形成了一门学科—细胞电生理学。最近50年，三次主要的技术革命推动了细胞电生理学的进展：细胞内记录，电压钳技术和膜片钳技术。 膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳（Patch Clamp）技术。1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50cm H2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声水平，实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。1983年10月，《Single-Channel Recording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里程碑，为细胞生理的研究带来了一场革命性的变化，膜片钳技术象基因克隆技术一样，给生命科学研究带来了巨大的动力。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 1995年，《Single-Channel Recording》 一书再版，增添了大量膜片钳技术的新内容，几乎当时国际上所有的知名膜片钳专家都参与了编写，成为目前膜片钳技术研究领域的最经典著作。
膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个 离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔 离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，该电流强度就代表单一离子通道电流。
膜片钳记录技术自创立以来，经历了许多发展变化：
磁石电话机
（1）记录方式有很大变化。除了传统的单通道记录方式以及普通全细胞记录方式外，又陆续发展了膜穿孔记录方式（Perforated patch clamp）、巨膜片记录方式（Giant membrane patch）、松散封接记录方式（Loose patch clamp）等等。
（2）应用技术不断涌现。例如，为了更换电极内液和从电极内施加药物，发展了微电极内灌注技术（Micropipette perfusion technique）；在研究细胞间的缝隙连接（Gap junction）
通道时，发展了双膜片记录法（Double patch recording）；将富含神经递质受体的游离膜片靠近突触部位，可检测递质释放和突触活动，这一技术称为膜片探针技术（Detector-patch technique）；若将特异的膜片探针插入卵母细胞，可检测细胞内第二信使含量，此为膜片填塞技术（Patch cramming technique）；为研究细胞的胞吞与胞吐机制，发展了膜电容测定法（Membrane capacitance measurement）。此外还有很多膜片钳应用技术，而且一些新的技术正不断涌现，膜片钳技术可以说是日新月异。
（3）使用的标本种类繁多。从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和 内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞；从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发 展到组织片（如脑片、脊髓片）乃至整体动物；从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母细胞发展到鸡细胞、大鼠细胞、人细胞等等；从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物 细胞。此外，膜片钳技术还广泛地应用到平面双分子层（Planar bilayer）、脂质体（Liposome）等人工标本上。
（4）研究对象已经不局限于离子通道。从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。
（5）膜片钳电极已经不单单是传统意义上的电信号记录电极，它还作为其它研究方法的工具使用，如用于进行单细胞PCR技术时的细胞内容物抽吸工具。 文丘里混合器
膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规方法，它不仅可以作 为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接为临床医学研究服务，目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、 中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。
膜片钳技术共有四种基本记录模式，其它记录模式都是在此基础上逐渐发展衍变而来的。这四种记录模式为：（1）细胞贴附记录模式（Cell-attached recording或On cell recording）；（2）内面向外记录模式（Inside-out recording）；（3）外面向外记录模式（Outside-out recording）；（4）全细胞记录模式（Whole-cell recording）。
前三种为单通道记录模式，其中内面向外和外面向外记录模式为游离膜片的记录模式（Excised patch recording）。将电极接触细胞膜，轻轻地给予负压吸引，就形成了细胞
贴附记录模式。将电极迅速提起，脱离细胞，因为细胞膜具有流动性，粘着在电极尖端上的细胞膜会自动融合，从而形成一个囊泡。当将电极提出浴液液面而短暂（1～2s） 暴露在空气中时，囊泡的外表面会破裂，再次将电极放入浴液，就形成了内面向外记录模式。另外，如果将电极放入低钙浴液中，囊泡的外表面也会破裂，同样形成 内面向外记录模式。形成细胞贴附记录模式后，采用继续施加负压或电击的方法打破细胞膜，即形成了全细胞记录模式。在形成全细胞记录模式后，将电极缓缓提 起，逐渐脱离细胞，同样因为细胞膜具有流动性，粘着在电极尖端上的细胞膜会自动融合，这样细胞膜外面就朝向电极尖端外，形成外膜向外记录模式。
◆◇◆ 膜片钳技术实验仪器配置
传统膜片钳系统的仪器配置分为单细胞膜片钳记录系统与脑片/组织片膜片钳记录系统。不同的记录系统需要不同的仪器配置。
一、单细胞膜片钳记录系统
一套完整的单细胞记录系统主要包括：
（1）膜片钳放大器：为膜片钳记录系统的核心，其特殊的电路设计能保障对微小通道电流的精确记录。随着技术的发展，膜片钳放大器的自动化程度越来越高，适合于各种各样的膜片钳乃至其他电生理实验的记录。如美国Axon（MDS）公司的MultiClamp 700B、Axopatch 200B；德国HEKA公司的EPC 10。
（2）数模/模数转换器：用于对模拟信号和数码信号进行转换。目前的数模/模数转换器多为16位高分辨率、多通道采集，如美国Axon（MDS）公司的Digidata 1440A。
（3）采样与分析软件：用于采集并分析通道信号。种类很多，美国Axon（MDS）公司的pClamp 10集采集、分析、统计和作图等功能于一身，是经典的膜片钳采样分析软件包。
（4）微操纵器：微操纵器是膜片钳实验所必需，用于调节记录微电极的位置使之与细胞形成封接，或调节给药电极或注射电极的位置，用于给细胞施加药物或向细胞内注射物质。目前常见的生产厂家有美国Sutter公司、WPI公司、Burleigh公司、SD公司等，如美国Sutter公司的电动微操纵器MP-285、MPC-385、MP-225等。
热水泵机械密封（5）倒置显微镜：目前我国市场上膜片钳实验常用的显微镜来自日本的Olympus和Nikon两大品牌，少数来自德国Leica与Zeiss公司。日本Olympus IX51/71/81是适合于进行单细
胞膜片钳实验的类型。
（6）显微镜扩展平台：放置在显微镜载物台两侧，用于固定微操纵器。厂家有美国Sutter公司、Burleigh公司、日本Narishige公司、国内东乐、仪博公司等。
（7） 微电极拉制仪：用于制备玻璃微电极。常见的有两种：一种为垂直型微电极拉制仪，利用金属丝（钨丝或铂丝）通过大电流将玻璃电极加热到熔点，通过重力拉断， 通常采用两步法拉电极。另一种是水平程控微电极拉制仪，采用微电脑控制，可设定拉力大小、拉制的时间、拉制的方式等参数。单步或多步拉制，拉制的电极形状 多种多样，适合于所有电生理实验。加热装置用铂片、钨钛合金、镍镉合金或激光，激光可拉制石英电极。常见的微电极拉制仪有美国Sutter公司的P-97、美国WPI公司的PUL-2、多管微电极拉制仪PMP-107以及日本Narishige公司的PC-10。
（8）微电极抛光仪：微电极拉制仪拉出的电极，电极的尖端往往不是很光滑。为了能与细胞膜间形成稳定可靠的封接，一般拉制出的微电极需要进行抛光处理（全细胞记录有时可不需要抛光），此时需要使用抛光仪。在单通道实验中还需要在微电极尖端涂上疏水硅胶树脂（Sylgard）以减小跨壁电容（Transmural capacitance）带来的噪声。常见的有日本Narishige公司的MF-830型、美国WPI公司的MF200。
（9）给药系统：研究离子通道时，观察药物的作用是基本的实验方法，依据实验目的和实验材料的不同，选用合适的给药系统是非常重要的。常见的厂家有美国ALA公司、Warner公司、WPI公司，如美国ALA公司的BPS-4/8PG型4/8道手动灌流系统、DAD-8/16VCP系列程控灌流系统、WPI公司的MPS-2等。压力？？？
树脂吸附（10）细胞记录槽：细胞（脑片/组织片）灌流槽是放置标本的浴槽，根据标本以及实验目的不同，其型号也各异，容量大小与设计也不同。RC系列细胞记录槽是美国Warner公司产品，较为常用。
（11）温度控制仪：在膜片钳实验中，常常需要将细胞或脑片/组织片保持在一个相对恒温系统中，以保持标本活性，这就需要有恒温控制仪。常见的有美国Warner公司的TC-324B、TC344B以及美国Dagan公司的PID－10、HCC-100A等。
（12）蠕动泵：用于将液体灌流给标本，维持标本的营养，保证其活性。其种类繁多，国产进口均有。国产的如河北兰格公司LEAD-2型，国外的如美国WPI公司的Peri-Star型蠕动泵。
（13）防震台与屏蔽网：在膜片钳实验中，细胞膜和记录电极尖端封接后, 震动极易使封接断开，从而导致实验失败。所以，整个实验使用防震台来减小震动显得非常重要。同时，
静电屏蔽网是防止杂电场（如日光灯，电脑等）对膜片钳放大器探头电路产生干扰的重要手段。常见国外厂家有美国TMC公司、Newport公司，国内的有仪博、东乐、亿奥、连胜等多家。如美国TMC公司的TMC63544型是一台性能优良的防震台，适用于膜片钳、细胞注射、光学、激光共聚焦显微镜等各种需要防震的实验中。
（14）仪器架：用于放置膜片钳实验仪器，专门为膜片钳以及其他电生理实验室设计。目前的仪器架设计非常灵活，可方便移动、拆卸与安装。如东乐公司生产的DL800型。
（15）计算机：用于采集、储存与分析数据。目前市售的Pentium以及更高级的计算机均可。不同的膜片钳仪器配置对计算机配置的要求基本一致。
（16）其他：还可根据实验要求配备监视系统（同时可用于教学）、示波器、打印机、优盘、移动硬盘等。
二、脑片/商品电子防盗系统组织片膜片钳记录系统
在一般单细胞记录系统的基础上，增加脑片/组织片制备和刺激隔离系统、更换一些配置就构成脑片/组织片膜片钳记录系统：
（1）用正置显微镜替换倒置显微镜：脑片/组织片膜片钳记录系统采用正置显微镜，高倍
物镜为浸水镜头，且为了满足可视效果，脑片/组织片膜片钳记录系统还需要红外线装置。日本Olympus的BX51WI型、Nikon公司的FN-1型等较为常见。
（2）用显微镜X-Y 移动台与支撑平台替换显微镜扩展平台：显微镜X-Y移动台用于脑片/组织片膜片钳记录系统中移动显微镜，便于实验标本的操作。Gibrtar型显微镜X-Y移动台是美国Burleigh公司产品，广泛用于脑片/组织片膜片钳记录系统，与Olympus BX51WI型正置显微镜配套使用。此外，美国Warner公司、国内也有生产。
（3）脑片/组织片切片机：在脑片/组织片的膜片钳实验中，常需要将脑/组织切成100-400μm左右的薄片，脑片/组织片切片机就是用于制备高活性脑片/组织片或组织片的设备。目前震动切片机最流行，常见的有美国WPI公司的NVSLM1型、美国Vibratome公司的Vibratome 1000型、德国Leica公司的VT-1000S、日本Dosaka公司的Microslicer DTK系列。
（4）刺激隔离系统：用于对组织施加细胞外刺激，如进行突触前单或串刺激诱发长时程增强（LTP）或长时程抑制（LTD）以及其他场电位的诱发。包括刺激器与隔离器（一般选择与刺激器配套的隔离器）。生产厂家有美国WPI公司、美国Cygnus公司、日本光电公司、美国A-M System公司、美国Warner公司等。如美国WPI公司的DS8000型、A300 Pulsem
aster多通道刺激器。
三、卵母细胞双电极电压钳记录系统 缘114
虽然可以在卵母细胞上进行膜片钳记录，但卵母细胞双电极电压钳记录准确说不属于膜片钳技术。卵母细胞双电极电压钳记录需要采用特殊的放大器、注射系统、体式显微镜等，主要配置为：（1）卵母细胞放大器；（2）数模/模数转换器；（3）采样与分析软件；（4）手动微操纵器；（5）微电极拉制仪；（6）体视显微镜；（7）给药系统；（8）注射系统；（9）细胞记录槽；（10）温度控制仪；（11）蠕动泵；（12）光源；（13）防震台与屏蔽网；（14）仪器架；（15）计算机。这些配置多与单细胞膜片钳记录系统一致，不同的如下：
（1）卵母细胞放大器：能够记录到卵母细胞全细胞大电流的放大器。常见的有美国Axon（MDS）公司的Axoclamp 900A、美国Warner公司的OC-725C、美国Dagan公司的TEV-200A型等。
（2）手动微操纵器：由于卵母细胞较大，采用精度不高、价格便宜的手动微操纵器即可。用于插入电极、向细胞内注射RNA等。
（3）体视显微镜：目前。
（4）注射系统：用于向卵母细胞内注射RNA等。常用的有美国WPI公司的Nanoliter 2000、UMP II等。
（5）光源：一般采用冷光源。美国WPI等多家公司有生产。
在 上述三种不同的仪器配置中，每一种仪器往往有多种型号，不同型号的仪器厂家往往是根据不同的实验目的而设计的，并非仪器越贵越好，所以需要根据研究人员的 研究目的和实验材料来选择不同型号的仪器。为此，要建好一套膜片钳实验系统，往往需要对实验目的、膜片钳实验技术和实验方法、各种仪器性能一定的了解。
◆◇◆ 其他细胞电生理记录技术
一般认为，细胞电生理学最早可追溯到1791年，意大利Bologna大学解剖学教授Luigi Galvani发现了神经肌肉的电现象。以后的两百多年间，电生理学在缓慢而持续地发展着，先后由Caton（1875年）发现脑电波、Bernstein（1902年）提出了生物电发生的膜学说、Sherrington（1897年）提出“突触”（Synapse）的概念，Adrian（1912年）确定了动作电位的“全或无”性质、Berger（1929年）记录并分析了脑电图等等。电生理学的核心技术是
微电极技术，英国剑桥大学的科学家Hodgkin和Huxley在这方面作出了杰出的贡献，上世纪50年代，他们创建了动作电位的钠学说，同时他们与澳大利亚科学家Eccles应用电压钳技术完成了一系列有关静息电位、动作电位、离子通道、神经冲动传导、中枢突触传递方面的重要研究。此外，英国科学家Katz在对神经末梢递质释放机制的研究中作出了重要贡献，提出了著名的递质释放的量子学说。这四位科学家的研究成果构成了近几十年来神经电生理学的主要内容。另外，电生理学的显著特点是它的每一步发展都与电学仪器的发明有关。如：1901年荷兰生理学家Einthoven发明弦线电流计，初步解决了电生理仪器中所要求的速度问题，同时他还研究成功世界上第一台心电图机；1922年美国科学家Erlanger和Gasser将阴极射线示波器引入电生理学研究，圆满地解决了记录电信号所需要的灵敏度和速度；1952年Cole和Marmont设计了电压钳仪器，为分离离子通道电流提供了可能。
时间进入1976年，两位德国科学家Neher和Sakmann在Hodgkin和Huxley采用微电极电压钳技术对离子通道进行研究的基础上，创造性地发明了膜片钳技术（Patch clamp techniques）。膜片钳技术的核心是其具有的低噪声膜片钳放大器，其关键因素是微电极与细胞膜的紧密接触，即通常所说的高阻封接（Giga-seal）。 膜片钳技术的出现使人们对离子通道本质的认识有了一个飞跃，也给电生理学的发展乃至细胞生物学研究带来了一场
伟大的革命，该技术及其在众多生物学领域里广 泛的应用已成为现代电生理学的主要内容。这一成果对于研究细胞功能的调控、离子通道病至关重要，可揭示神经系统、运动系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病 的发病机理，并提供的崭新途径。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议