印丽，邱树毅，曹文涛，班世栋，王晓丹
便民充值（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550025） 摘要：本研究以茅台镇酱香型白酒核心产区大曲及从中分离的霉菌为研究材料，分析茅台镇酱香白酒5个酒厂酿造大曲的理化指标、水解酶活及其霉菌水解酶组成及酶活，以进一步解析酱香大曲霉菌与大曲功能的关系。结果显示，酱香型大曲间糖化力86.91~535.06 mg/(g·h)差异较大，其它理化指标无显著差异，且5种大曲中都能检测到多种水解酶酶活，但液化酶、糖化酶、纤维素酶、脂肪酶、植酸酶差异较大，可能与大曲中的霉菌种类有关。此外，分析从大曲中分离霉菌产酶活性，发现分离霉菌能产多种酶，且霉菌产糖化酶酶活（0~1724.56 U/g）和中性蛋白酶酶活（0~2671.00 U/g）差异较大。曲霉主要产糖化酶、蛋白酶、果胶酶等，毛霉主要产糖化酶和蛋白酶，根霉主要产糖化酶，青霉主要产脂肪酶和果胶酶，说明霉菌对大曲中酶系的形成有重要作用。 关键词：酱香型大曲；霉菌；酶活
文章篇号：1673-9078(2021)03-89-96 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2021.3.0749 Analysis of Daqu Enzymes from the Core Production Area of
Maotai-flavor Liquor
YIN Li, QIU Shu-yi, CAO Wen-tao, BAN Shi-dong, W ANG Xiao-dan
(School of Liquor and Food Engineering Guizhou University, Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy of Guizhou Province Guizhou University, Guiyang 550025, China) Abstract: In this study, Daqu from the Maotai-flavor liquor core production area of Maotai Town and the molds isolated from the Daqu were used as research materials, the physicochemical indices, hydrolase activity, fungal hydrolase composition and enzyme activitiesof the Daqu samples of five Maotai-flavor liquor distilleries were analyzed, and the relationship between the moldsof Maotai-flavor Daqu and the function of Daqu. The results showed that the saccharification powerof Maotai-flavor Daqu differed significantly 86.91~535.06 mg/(g·h), with insignificant differences in other physical and chemical indices. The activities of various hydrolases were detected in all the five Daqu samples, but the differences of liquefaction enzyme, saccharification enzyme, cellulase, lipase and phytase were relatively large, which might be related to the mold species in Daqu. In addition, the analysis of the enzyme-producing activity of the mold isolated from Daqu revealed that the isolated molds could produce a variety of enzymes, and the activities of saccharification enzyme (0~1724.56 U/g) and neutral protease (0~2671.00 U/g) were different. Aspergillus sp. mainly produced saccharification enzyme, protease and pectinase, Mucor sp. Mainly produced saccharificat
ion enzyme and protease, Rhizopus sp. mainly produced saccharification enzyme, Penicillium sp. mainly produced lipase and pectinase, indicating that molds play an important role in the formation of the enzymatic system in Daqu.
Key words: Maotai-flavor Daqu; mold; enzyme activity
引文格式：
印丽，邱树毅，曹文涛，等.酱香型白酒核心产区大曲的酶系分析[J].现代食品科技,2021,37(3):89-96
YIN Li, QIU Shu-yi, CAO Wen-tao, et al. Analysis of Daqu enzymes from the core production area of maotai-flavor liquor [J]. Modern Food Science and Technology, 2021, 37(3): 89-96
收稿日期：2020-08-12
基金项目：贵州省科技计划项目（黔科合支撑[2018]2834；黔科合平台人才[2018]5251；黔科合平台人才[2019]5645）；贵州大学培育项目（黔科合平台人才[2017]5788-23）
作者简介：印丽(1995-)，女，硕士研究生，研究方向：微生物代谢调控 通讯作者：王晓丹（1980-），女，博士，正高级实验师，研究方向：发酵工程
酱香型大曲是以纯种小麦为原料制成的含多种微生物和酶的发酵剂，制曲温度在60~65 ℃，为白酒提供微生物、酶系、风味物质，以及风味前体物质[1-3]。在大曲的发酵以及贮存过程中，由于微生物的生理生化代谢会产生一系列的酶，如酸性蛋白酶、中性蛋白酶、液化酶、糖化酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、脂肪酶、单宁酶和植酸酶等，进而形成了酱香大
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曲特有的酶系[4-6]。这些酶能将原料中大分子物质降解成为小分子，以供微生物生长利用及发酵代谢[7]。其中一些代谢产物是白酒中重要的风味物质或风味前体物质，这些代谢产物虽含量低，却对酱香型白酒风格特征的形成具有重要作用。
大曲中含有丰富的霉菌，且大多数的霉菌都参与酒醅发酵[8]，研究表明，霉菌代谢为大曲提供了丰富的酶系[9]，推动了大曲的发酵成熟，对大曲质量以及功能特性的形成起着关键作用[10]。酱香大曲分离的霉菌均能产生糖化酶、液化酶、蛋白酶，是酿造原料降解的高活性酶[11]，青霉、曲霉、毛霉是产这三种酶的主要菌[12]。有研究对酱酒各主酿区霉菌差异性进行分析，发现各主酿区霉菌种结构在大曲样品中的差异性较高，但主体发酵菌相似[13,14]；同时有研究发现，酿造大曲各轮次霉菌之间传承性较强，起主导作用霉菌具有极强的传承性[15]。
一直以来学界缺乏针对大曲霉菌多样性类结构与产酶特性之间联系的研究，不同种类的霉菌在酿造
过程中代谢的酶类存在差异，发挥不同的功能，霉菌类的差异必然影响酶种类及酶活差异，因此探究二者的关系可以更加明确酱香大曲各种具体特征品质的来源。本研究以贵州遵义地区的酱香大曲及从中分离的霉菌为研究材料，研究大曲的理化指标和水解酶系，同时测定了霉菌水解酶的组成及酶活，对比分析大曲霉菌与大曲酶系及理化指标的关系，以进一步研究大曲微生物与大曲功能的关系。
1 材料与方法
1.1 材料与培养基
1.1.1 材料
样品：贵州遵义茅台镇区域5个酒厂酿酒曲粉。样品编号为MF01、MF02、MF03、MF04、MF05。
1.1.2 菌种
菌株为筛选自茅台镇5个酒厂大曲的66株霉菌，其中：20株曲霉属、10株散囊菌属、8株毛霉属、8株拟青霉属、6株横梗霉属、5株青霉属、3株犁头霉属、2株根毛属、2株根毛霉属、1株红曲霉属及1株嗜热子囊菌。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉0.5%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，氯霉素0.01%，pH 5.8~6.2。
麸皮培养基：15 g麸皮（过40目筛）、15 g蒸馏水，121 ℃灭菌20 min。1.2 仪器与设备
超净工作台（SW-CJ-LFD），苏州市金净净化设备科技有限公司；霉菌培养箱（BMJ-250B-Z），上海实业有限公司医疗设备厂；立式压力蒸汽灭菌锅，上海实业有限公司医疗设备厂；可见光分光光度计（722S），上海菁华科技仪器有限公司；光学显微镜，日本尼康；电子天平（FA2004N），上海菁海仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 大曲的理化指标测定
大曲的酸度、淀粉、水分、氨基酸态氮、发酵力、酯化力、糖化力和液化力的测定参照行业标准《酿酒大曲通用分析方法》[16]。
绝缘法兰1.3.2 霉菌粗酶液制备
伴热管线
将从大曲中分离得到的霉菌接种到PDA斜面上活化，挑取单菌落接种到PDA斜面培养，用无菌生理盐
水洗去试管斜面上的孢子，以10%的接种量接种到麸皮培养基培养，称取培养物稀释10倍，40 ℃水浴1 h，每隔15 min搅拌一次，滤纸过滤，用于测定酶活[16]。
1.3.3 酶活测定方法
酸性、中性蛋白酶测定方法参照国标蛋白酶活力测定法[17]；液化酶测定测定方法采用Y oung J. Y oo改良法[18]；糖化酶测定测定方法采用DNS法[19]；纤维素酶测定测定方法采用DNS法[20]；半纤维素酶测定测定方法采用DNS法[21]；果胶酶测定测定方法采用国标食品工业用酶制剂GB 1886.174-2016[22]；脂肪酶测定测定方法采用国标脂肪酶酶活检测方法GB/T 23535-2009[23]中电位滴定法；单宁酶测定测定方法采用分光光度法[24]；植酸酶测定测定方法采用国标饲用植酸酶活性的测定GB/T 18634-2009[25]。
2 结果与分析
2.1 大曲的理化指标和大曲的酶系
大曲是以纯种小麦为原料制成的含有多种微生物和酶类的发酵剂，以5个酱香大曲作为实验材料，测定大曲的各理化指标（酸度、淀粉、水分、氨基酸态氮、发酵力、酯化力、糖化力和液化力）以及蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、单宁酶和植酸酶构成的酶系。
大曲的水分、酸度、淀粉、氨基酸态氮等是评价大曲质量的主要理化指标，对5种酱香大曲测定理化
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指标及大曲水解酶活测定结果如表1、2所示。大曲水分含量与大曲微生物生长及酶的生成密切相关，对大曲品质具有显著影响，一般成品曲水分含量不高于13%，若大曲中水分含量太高，大曲易发生二次生霉[26]，同时水分含量亦不可过低，过低则影响微生物生长代谢及酶活，使大曲质量降低。大曲微生物不能直接利用淀粉进行发酵，因此需要将原料中的淀粉进行糖化降解，大曲糖化力与糖化酶活力和液化酶活力密切相关，糖化力高则大曲中淀粉利用率高，关系到原料的糖化结果，影响白酒的出酒率。结果显示各大曲均有糖化酶和液化酶含量高而淀粉含量低的趋势。大曲样品中糖化酶酶活力在445 U/g~1263 U/g，差别很大，使得各大曲的糖化力差异大。而糖化酶和液化酶活力大小与大曲中微生物的生长、繁殖、代谢直接相关，尤其是霉菌，其中曲霉、根霉对大曲糖化力影响较大。糖化酶作为淀粉水解酶，作用于淀粉的非还原性末端的α-1,4-葡萄糖苷键，可将淀粉、糊精等水解为葡萄糖，且有助于酵母分解葡萄糖生成乙醇[19,27]。酱香大曲由纯种小麦制得，而小麦中淀粉的含量最高，为微生物生长代谢提供丰富的糖源。
表1 大曲理化指标
Table 1 The physicochemical parameters in five Daqu
大曲水分/%
酸度/
(mmol/10 g)混凝土表面增强剂
淀粉含量
/(g/100 g)
氨基酸态氮
/(g/kg)
酯化力/
(mg/50 g·7 d)
发酵力/
(g/0.5 g·72 h)
输液瓶
液化力/
(g/g·h)
糖化力/
(mg/g·h)
MF01 9.54±0.07 1.40±0.02 63.84±0.00 3.28±0.00 9.68±1.49 0.09±0.01 0.01±0.00
204.21±6.61
MF02 12.13±0.05 1.27±0.05 66.47±0.00 3.43±0.02 8.93±0.74 0.58±0.01 0.01±0.00 86.91±0.68
MF03 7.78±0.07 1.10±0.00 62.64±0.06 4.00±0.01 14.88±3.71 0.32±0.01 0.01±0.00 186.10±2.91
MF04 11.63±0.06 1.69±0.02 59.84±0.98 4.33±0.04 13.60±7.56 0.42±0.06 0.01±0.00 535.06±0.00
智能公交管理系统
MF05 9.10±0.03 1.66±0.04 67.70±0.09 3.70±0.02 8.31±0.76 0.37±0.02 0.01±0.00
304.83±1.22
表2 大曲的水解酶系（U/g）
Table 2 The hydrolytic enzymes in five Daqu
样品酸性蛋白酶中性蛋白酶液化酶糖化酶纤维素酶
MF01 45.72±11.59 20.66±3.00 156.60±10.45 732.58±12.87 0.00±0.00 MF02 72.19±4.23 11.70±2.42 15.68±4.83 445.65±12.66 0.00±0.00 MF03 69.75±1.64 11.92±4.64 357.12±0.65 727.92±19.64 0.00±0.00 MF04 20.52±2.97 19.25±1.67 308.06±1.95 1263.13±42.02 45.49±1.02 MF05 12.76±4.65 11.71±2.49 389.58±1.58 523.46±16.13 3.61±1.80 样品半纤维素酶脂肪酶果胶酶单宁酶植酸酶
MF01 0.06±0.01 3.18±0.95 147.02±4.14 0.47±0.15 4.78±1.57 MF02 0.06±0.00 23.15±7.00 124.55±20.76 0.19±0.08 1.49±0.29 MF03 0.17±0.01 3.27±0.73 133.32±14.36 1.31±0.20 1.00±0.00 MF04 0.00±0.00 1.36±0.34 180.95±4.16 0.07±0.06 43.92±1.71 MF05 0.00±0.00 10.24±2.79 179.96±4.14 0.12±0.05 33.61±0.58
同时，大曲中果胶、蛋白质、脂肪和纤维素等的降解也有利于原料中淀粉的降解，各样品中都检测到酸性蛋白酶、中性蛋白酶和果胶酶，而纤维素酶只有在MF04和MF05中检测到，半纤维素酶在这两个大曲中并未检测到，而这两种酶的加入好像对淀粉含量没有太大影响，可能与大曲制作时就已经粉碎，
原料中就已经有大量的淀粉有关。大曲中氨基酸态氮的含量与大曲中酸性蛋白酶的活力以及产酸微生物有着密切关系，蛋白酶降解小麦中的蛋白质成小分子的多肽和氨基酸，使得大曲中的酸度增高，由于蛋白质对淀粉的包裹作用，阻遏淀粉的降解速度，因此提高蛋白质的降解速度，有利于淀粉的降解，大曲中MF01、MF03和MF02的两种蛋白酶活性相对较高，但酸性并不高，说明降解的氨基酸参与了微生物的生长代谢。在微生物生长过程中，氮源的含量影响微生物的生长代谢，高含量的氨基酸促进酵母的代谢，同时为美拉德反应提供了前驱物质。此外产酒酵母和产酯酵母是提供大曲发酵力和酯化力的主要微生物，从结果可知，各样品都有一定的发酵力和酯化力，MF01的发酵力很低，应该与酵母的数量和种类有关，酯化力没有明显差异。大曲中的生酸微生物能够利用淀粉、脂肪、蛋白质的降解以及有机酸代谢产酸，因此大曲酸度与大曲中糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、脂肪酶等活力高低以及产酸微生物密切相关，但从结果可以看到
91
92
MF02的蛋白酶和脂肪酶含量都比较高，但酸度并不高，可能生成酸代谢为其它物质，如酯类。此外，酸性蛋白酶分解大曲原料中蛋白质生成的多肽及氨基酸等白酒呈香物质或者前驱物质，同时，氨基酸和还原糖可以发生美拉德反应，生成了白酒呈香物质的前驱物质，有文献报道大曲中的酸性蛋白酶的主要来源为米曲霉、黑曲霉、根霉[28]，这种酶活的差别可能与霉菌的类组成有关系。
图1 大曲酶系主成份分析图
Fig. 1 The principle analysis of Daqu enzymes
由图1的主成分分析图可以明确看出各个样品之间酶类组成的差异，以及形成这种差异的酶类。单宁酶（Tannase ）是直接影响MF01与其他样品差异的酶类，高粱为白酒发酵原料，高粱含有单宁，单宁能和蛋白质发生络合反应而沉淀，从而影响了微生物的代谢和生长，而微生物产生的单宁酶能降解原料中的单宁，降低单宁的毒性作用，而且单宁酶可降低白酒的苦涩味，对白酒的口感有改善作用[24,29]。半纤维素酶（Hemicellulase ）、植酸酶（phytases ）是影响MF04与MF05位置关系的酶类，微生物降解半纤维素比纤维素快，半纤维素降解产物在代谢过程中有乙醇、呋喃衍生物和芳香化合物的生成，而且有些脂肪酸会抑制降解半纤维素[30]。脂肪酶（Lypase ）决定了MF02与其他样品的区别，在白酒发酵过程中，脂肪酶对酒醅发酵时的酯类物质影响较大，能提高白酒总酯的含量，从而促进白酒中酸、醇和酯的平衡[31-33]。
白酒作为一种具有独特发酵工艺和复杂微生物落的传统固态发酵产物，是由酵母、霉菌、细菌等多种微生物构成的发酵微生物落在自然环境和人为调节的影响下通过天然发酵形成的风味代谢产物。酱香大曲生产过程中，微生物的生长繁殖代谢过程会产生各种酶类，从而形成了酱香大曲的酶系，使得酱香大曲具有酯化力、发酵力、糖化力、液化力等。由于制作大曲的原料品质不同以及地理位置和制作工艺等存在一定差异导致微生物菌存在差异性，因此5个酒厂大曲理化指标存在一定差异。而大曲这些动态理化
数据体现了大曲的品质，为进一步提高酱香大曲品质提供了理论依据。
2.2 大曲中霉菌产酶与霉菌类关系
霉菌是作为固态法白酒酿造过程中的关键微生物，具有协同发酵的作用，能够大量产生糖化酶、蛋白酶等重要的水解酶类，为整个发酵体系提供基础酶动力。各种霉菌生长代谢对大曲中酵母菌和细菌等微生物落结构的形成以及菌种代谢途径有着十分重要的影响，因此环境及菌的差异造就了大曲不同的酶活特性。通过探究霉菌的产酶特征，并分别绘制霉菌产酶箱线图以及星形图反映检测的霉菌类对大曲酶活体系的影响。
2.2.1 不同大曲中霉菌产酶星形图
星形图反映了大曲中各株霉菌产水解酶活力信息（图2），其中，每个小星形图代表了一种霉菌菌种，以不同颜星形图扇形表示水解酶系的种类，且各水解酶相对活力大小以扇形半径表示，扇形半径越长则代表此扇形所对应酶的相对酶活力越大。
图2 五种酱香大曲霉菌产酶星形图
Fig.2 Star graph of fungus’ enzyme production in five kinds of
sauce-flavor Daqu
在产糖化酶上，5种酱香大曲中有六种霉菌表现了较高的产糖化酶能力包括：Aspergillus flavus 、Rhizomucorpusillus 、Monascus purpureu 、Mucor
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purpureu 、Paecilomyces variotii 、Eurotium amstelodami 、Penicillium roqueforti ，酶活力>1000 U/g 。Aspergillus flavus 、Rhizomucorpusillus 、Monascus purpureu 、Mucor purpureu 菌株有研究证实在清香[34]、酱香大曲[35]、酱油[36]、黄豆酱[37]和食醋[38,39]等发酵产品中为糖化酶的重要来源。特别是Aspergillus flavus 在酱香大曲中表现了很强的糖化酶活力。Paecilomyces variotii 、Eurotium amstelodami 、Penicillium roqueforti 三株霉菌则为此次酱香大曲中发现的新型主要糖化菌株。
霉菌菌株也是酱香大曲中蛋白酶的主要来源，研究中共有9株霉菌包括：Aspergillus flavus 、Aspergillus tamarii 、Monascus purpureus 、Lichtheimia corymbifera 、Lichtheimia ramosa 、Euroti
um cristatum 、Eurotium amstelodami 、Aspergillus fumigatus 和Aspergillus nidulans ，酶活力>100 U/g 。其中Aspergillus flavus 、Aspergillus tamarii 、Monascus purpureu s 在酱油、食醋、浓香及酱香白酒酿造中是蛋白酶的主要分泌菌株。此外，Lichtheimia corymbifera 、Lichtheimia ramosa 、Eurotium cristatum 、Eurotium amstelodami 、Aspergillus fumigatus 和Aspergillus nidulans 等是此次研究新发现的高产蛋白酶活菌株。
与图2对比发现大曲中的纤维素酶活力较低有的样品几乎没有，大曲中多数霉菌产纤维素酶活力0.36~2.07 U/g 。脂肪酶活力整体也不高，在脂肪酶活力>20.0 U/g 的菌株中发现，Penicillium griseofulvum 是一种耐酸微生物，主要代谢产生苯并呋喃酮类、内酯类及聚酮类化合物[40]，本实验首次发现其具有产脂肪酶能力。
与图2对比发现大曲中的果胶酶活力120~180 U/g ，霉菌为大曲提供了大量的果胶酶；Eurotium amstelodami 、Penicillium chrysogenum 、Paecilomyces variotii 、Monascus purpureus 、Aspergillus sydowii 提供了超过180 U/g 的果胶酶。
Monascus ruber 、Monascus purpureus 菌株均属于红曲霉属，是浓香型白酒发酵的主要功能菌，能产生蛋白酶、糖化酶、麦芽糖酶、果胶酶等酶类以及红曲素、麦角甾醇、γ-氨基丁酸等生理活性物质[41]，由实验证明他们在酱香型白酒高温大曲中也表现出较高的产酶特性。通过上述分析，可见酱
香大曲中的各种霉菌类的产酶功能性呈现出多样性特点，不同种类的霉菌在酿造体系中各司其职，产出多种水解酶类以促进原料的降解；大曲霉菌类结构与产酶特性之间的确存在重要的联系，也正是由于独特的霉菌类结构特征，造就了大曲产酶特性，从而赋予酱香大曲优秀的品质。
2.2.2 大曲中霉菌产酶箱线图
结合图3分析各大曲霉菌产水解酶能力，分析霉菌类组成与总体霉菌产酶特征的联系。图中矩形方框的大小表示一种大曲中各霉菌菌属生产该种水解酶能力的大小，方框跨越的范围越大，产酶能力差异也越大。酱香大曲总体产糖化酶的活力都明显高于其它水解酶类（表2），Aspergillus sp .、Rhizopus sp.等菌属具有较为突出产糖化酶能力，而酱香性大曲以Aspergillus sp .、Rhizopus sp.、Lichtheimia sp.为主要优势菌的霉菌落结构，必然造成大曲呈现出良好的糖化降解性能，同时各大曲间存在的糖化酶活力差异，也与优势菌属含量分布的不同有密切联系。如MF03样品产蛋白酶能力较弱，另4种样品则具有较高能力且产酶能力相似，但具体功能菌株差异较大，主要产酶优势菌Aspergillus sp.、Rhizopus sp.总体含量高，进而导致了类似且突出的产蛋白酶能力[42,43]，也由于Lichtheimia sp.、Eurotium sp.等重要功能菌类结构的区别，形成了样品间的差异。
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