蛋白实验技术——免疫组化实验步骤
（一）、仪器设备
1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。
2. 水浴锅。
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（二）、试剂
1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液： 用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。
8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。
（三）、操作流程
1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： A 抗原热修复
a 高压热修复： 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b 沸热修复：电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
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c 微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等。
B 酶消化方法：常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
（四）、免疫组化染SP法
（1） 脱蜡、水化；分子动力学仿真
（2）PBS洗2-3次各5分钟；
（3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
（4）PBS洗2-3次各5分钟；
（5）抗原修复；
（6）PBS洗2-3次各5分钟；
（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体；
（8）滴加一抗50μl，室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时；
（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟；激光模组
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（10）PBS洗3次每次2分钟；
（11）滴加Ⅱ抗45-50μl，室温静置或37℃1小时；
（12）二抗中可加入0.05%的 tween-20；
（13）PBS洗3次各5分钟；
（14）DAB显5-10分钟，在显微镜下掌握染程度；
（15）PBS或自来水冲洗10分钟；
（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
（17）自来水冲洗10-15分钟；
（18）脱水、透明、封片、镜检。
（五）、SABC法顺桨
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