实验室做细胞常⽤的细胞固定与染⾊⽅法
⼀、爬⽚前盖玻⽚处理⽅法
对于悬浮培养的细胞，在进⾏各种染⾊前常需先制备成涂⽚。为了保证细胞在长时间的染⾊过程中不从载玻⽚脱落，必须使其牢固贴附于载玻⽚上。在载玻⽚上涂布⼀层有助于细胞黏附的物质是经常采⽤的⽅法之⼀。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这⾥介绍多聚赖氨酸的涂布⽅法。 1、将载玻⽚⽤玻璃专⽤洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。
刺辊
2、⽤⾃来⽔冲洗5min。
3、以1％盐酸—70％⼄醇溶液浸泡5min。
4、烤箱⼲燥(⾄此即可⽤于普通染⾊)。
5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离⼦⽔)浸泡5min，振荡。
6、⼊60℃烤箱1 h，或室温过夜⼲燥(⽤于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。
⼆、细胞固定常⽤⽅法
固定细胞的⽬的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发⽣降解、⾃溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防⽌细胞和组织的各种分⼦变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制⽚过程中亦不发⽣改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着⾊，适于观察、长期保存和分析。 1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选⽤新鲜培养物；根据检测⼯具、对象、⽬的和要求选择固定剂和固定⽅法。
2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖⽚悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖⽚单层培养物都可作固定材料。对双盖⽚悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离⼼收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制⽚；对盖⽚单层培养物来说，将盖⽚从培养器⽫中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去⾎清和附着于细胞表⾯的残渣，备固定⽤。
3.常⽤固定液：常⽤的固定液分两类，⼀类是以单⼀化学物质配成的固定液，称简单固定液。主要有甲醇、⼄醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊⼆醛、、铬酸、重铬酸钾、、氯化镉、(锇酸)。另⼀类是⽤两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA 固定液、 Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann 固定液、Bouing固定液等。金刚石复合片钻头
不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定⽬的的基础。
(1)4％甲醛-PBS：甲醛是⼀种⽓体，其饱和⽔溶液⽆⾊，约含40％甲醛。在很多情况下，甲醛常常产⽣多聚甲醛的⽩⾊沉淀。4％甲醛-PBS使组织变硬速度⽐⼄醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制⽚影响，固定材料可⽤苏⽊精和其他合成染料染⾊。甲醛的穿透⼒较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，⼤标本的固定和保存多⽤甲醛。甲醛是染⾊体、线粒体和⾼尔基体的固定液，在冷冻切⽚中，甲醛作固定剂具有显著的优点。⽤40％甲醛⽔溶
液:PBS=1:9配⽅制备甲醛固定液。
(2)丙酮：丙酮为⽆⾊易挥发液体，⽤纯冷丙酮(4℃)固定细胞内酶效果较佳。
(3)⼄醇：⼄醇⼜称酒精，固定⾎纤维蛋⽩、⾊素、弹性纤维、细菌和⽩细胞等效果优良。⽆⽔⼄醇或⼄醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定
液。⼄醇除有固定作⽤外，还具有硬化和脱⽔的作⽤。作为固定⽤⼄醇的适宜浓度为70％～100％。⼄醇的缺点是渗透⼒差，并使组织收缩。
(4)醋酸：常⽤0.3％～5％浓度的醋酸作固定剂。醋酸能和⽔及⼄醇、甲醇溶合，醋酸不固定蛋⽩质，
但能固定核酸。醋酸的穿透⼒很⼤，它对细胞的膨胀作⽤显著，这是由于它破坏了某些蛋⽩质分⼦的结合，所以，常⽤醋酸来减少其他固定剂引起的细胞收缩。细胞学技术中，它能防⽌细胞收缩，并能较好地保存染⾊体，还能把染⾊质沉淀成为可染⾊的块状体。
(5)：是黄⾊结晶体，强酸，可溶于⽔、⼄醇、苯和⼆甲苯，在⽔中的溶解度可因⽔温变化⽽变化。可以沉淀⽩蛋⽩、核蛋⽩、球蛋⽩、组蛋⽩和核酸。的穿透⼒很慢，单独使⽤时，造成组织严重收缩。它和其他药物混合配制时，可以作为蛋⽩质的沉淀剂，同时可避免组织收缩、硬化，⽽且易于染⾊。所以在很多混合固定液中被⼴泛采⽤。作固定⽤的最适浓度为1％。
(6)锇酸()：锇酸是⼀种强氧化剂，不能同⼄醇和甲醛混合使⽤。它的挥发性很强，挥发出来的⽓体能固定结膜，对眼睛很有害，所以操作时应特别注意。是保存细胞结构的最好固定剂之⼀，配制时先在棕⾊试剂瓶中盛⼊50～100ml
0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0～7.4)，再将装有1g锇酸的安培瓶放⼈PBS中，以玻棒击碎安培瓶，摇荡使锇酸溶解，备⽤。常⽤的固定液浓度为1％～2％。
(7)戊⼆醛：戊⼆醛对组织的渗透率⾼，与蛋⽩质反应快，能较好地保存蛋⽩质，对微管和膜性结构保存亦⽐较好，并能较好地保存糖原。常⽤的戊⼆醛固定液配制⽅法列于表12-1。
表12-1 常⽤的戊⼆醛固定液配制⽅法擦鞋纸
(8)甲醇／醋酸固定液：甲醇：醋酸为3:1的固定液是应⽤最⼴的⼀种培养细胞固定剂。甲醇穿透⼒好，醋酸固定蛋⽩效果好，两者结合，能使固定细胞形态不变。不仅最适⽤于固定染⾊体，⽽且固定的染⾊体适于Giemsa染⾊(注意：此固定液宜现⽤现配)。
(9)FAA固定液：此固定液适⽤于固定盖⽚单层培养的细胞，固定效果好。配制⽅法：90ml 80％酒精中加5ml冰⼄酸和
5m140％甲醛。
(10)Carnoy固定液：Carnoy固定液是较好的⾮⽔溶性固定液，是显⽰细胞化学成分(如粘多糖等)时常⽤的固定剂，固定、保真效果好，但穿透⼒差，适于固定培养的单层细胞。配制⽅法：60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰⼄酸。
(11)Bouin固定液：⽤于固定双盖⽚法培养的标本，固定30分钟后，⽤70％酒精褪去黄⾊，如不⽴即染⾊，可将标本保存在70％酒精中。本试剂适于固定组织细胞的糖原。配制⽅法：先将75ml饱和
(100ml⽔中加1.2～1.4g)过滤，加⼊25ml 福尔马林(40％甲醛，有沉淀时禁⽤)，最后加⼊5ml冰醋酸，混和后存于4℃冰箱中备⽤。冰醋酸最好在临⽤前加⼊。该固定液对组织细胞穿透⼒较强，固定效果较好，保存的细胞结构完好。但因偏酸(pH为 3～3.5)，对抗原有⼀定损害。
(12)4％多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛为⽩⾊固体，在50ml蒸馏⽔中加⼊4g多聚甲醛，加热⾄60～70℃时，边搅拌边逐滴加⼊2mol/LNaOH，⾄液体清晰透明。⽤1mol/LHCl调节pH ⾄7.4，冷却后加⼊ 0.01mol/LPBS液⾄100ml，4℃保存。本试剂适于固定肾纤维蛋⽩和细胞⾻架蛋⽩。
三、常见的细胞染⾊⽅法
1普通染⾊观察
苏⽊精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染⾊和Giemsa染⾊是观察培养细胞⼀般形态的最常⽤⽅法，也是把细胞作为标本保存的主要⽅法。对于贴壁培养的细胞，以⽣长于盖玻⽚和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先⽤Hanks液、PBS、BSS或⽣理盐⽔清洗培养物2次，去除妨碍染⾊的⾎清。固定后可将盖玻⽚⽤树胶贴于载玻⽚上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离⼼沉淀(1000r／min，10min)，弃上清液后(留少量液体)，将细胞悬液滴于玻⽚上做成涂⽚，冷风吹⼲。
1.1HE染⾊法
1.1.1染液配制
(1)苏⽊精染液：这⾥介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。称取0.5g苏⽊精，5.0g
虚拟试衣技术
铵矾或钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏⽔。再加⼊30ml⽢油， 2ml冰醋酸。混匀。过滤后即成母液。可长久保存。⽤蒸馏⽔以1:20稀释即成⼯作液，可⽤很长时间。每次染⾊前宜过滤，去除氧化膜。
台球杆架(2)伊红染液：伊红有醇溶性与⽔溶性之分。将0.5g伊红溶于100m170％⼄醇或蒸馏⽔即成⼯作液。
1.1.2染⾊程序
（1）⽤10％甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min。
（2）蒸馏⽔洗1次后，⼊苏⽊精染液5～10min染细胞核。
（3）⼊0.5％盐酸-70％⼄醇溶液30～1min，脱去胞质的着⾊。此时核呈紫红⾊。
（4）⼊碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝⾊。如果时间允许，最好⽤⾃来⽔(呈弱碱性)长时间浸泡。也可⼊1％NaHCO3溶液。此过程须不断⽤显微镜监视，以掌握碱化时间。
（5）蒸馏⽔洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着⾊。
（6）⼊伊红染液30s～1 min。
（7）⽤梯度⼄醇溶液脱⽔：70％、90％、95％⼄醇各30s～1 min；100％(2次)各2min。如伊红为⼄醇溶液，略去70％⼄醇。
（8）⽤⼆甲苯透明2次，各5min。
（9）树胶封固。
1.1.3染⾊结果
自攻丝
细胞核呈紫蓝⾊或深蓝⾊，⼤部分细胞的胞质呈粉红⾊。如果胞质内含较多核糖体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝⾊。
1.2吉姆萨染⾊法
此法可将细胞核与胞质同时染⾊，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染⾊稳定。
1.2.1吉姆萨(Giemsa)染液的配制
（1）取1.5g吉姆萨粉末放⼊50ml⽢油，置于60℃温箱，约3h后溶解。
（2）取出后倒⼊50ml中性甲醇，即为母液。于棕⾊瓶可长久保存。需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染⾊。
（3）将母液与0.1 mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成⼯作液。吉姆萨染
液对pH极敏感，偏酸时染⾊过红，偏碱时则过蓝。所以，⼯作液宜现⽤现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。
1.2.2染⾊程序
（1）将标本⽤甲醇固定5～10min。
（2）⼊吉姆萨液染⾊10～15min。可⽤染⾊缸；或将染液滴覆于标本。（3）蒸馏⽔清洗，空⽓⼲燥，⼆甲苯透明，树胶封固。
1.2.3染⾊结果
细胞核呈蓝或蓝紫⾊，胞质呈⾊与HE染⾊相仿。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议