喻俊磊
【摘 要】This paper summarized the research progress in the application of zebra fish in developmental genetics, human disease model and new drug screening, environmental toxicology and so on.%综述了斑马鱼在发育遗传学、人类疾病模型及新药筛选、环境毒理学等方面的研究应用进展.
【期刊名称】《江西农业学报》
【年(卷),期】个人信息系统2012(024)003
【总页数】4页(P108-110,113)
200gana-580【关键词】斑马鱼;模式动物;发育遗传学;环境毒理学
【作 者】喻俊磊
【作者单位】南昌大学生命科学与食品工程学院,江西南昌330031
【正文语种】中 文
太空风洞
【中图分类】S917.4
目前，无脊椎模式动物的研究已经在遗传生物学、发育生物学及相关领域取得了极大的进展，并获得了很多研究成果，但由于无脊椎动物与脊椎动物在胚胎结构、胚胎发育过程中的形态发生以及器官形成等方面都存在较大的差异，而且其中的有些特征是无脊椎动物模型所不具有的。斑马鱼作为一种新型的脊椎模式动物，研究脊椎动物发育机制、遗传突变和疾病，尤其是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选，这些特点使得斑马鱼成为生命科学研究领域中重要的脊椎模式动物之一。 斑马鱼(Danio rerio)属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)，其成鱼体长4～6 cm，适宜发育温度为25～31℃，其产卵时间可以通过控制雌雄鱼的接触或调控光周期来控制，成鱼常年产卵并且产卵量大，每周可产卵200～300个，鱼卵易收集，从受精卵发育至性成熟仅需2～3个月。美国著名遗传学家George Streisinger［1］最早对斑马鱼进行研究，经过30多年的研究应用和系统发展，已有众多的斑马鱼品系正被广泛运用于生命科学研究的各个领域。本文就斑马鱼在发育遗传学、人类
疾病、环境毒理学等主要研究领域作一综述。
1 发育遗传学的最佳模式动物
斑马鱼作为发育生物学和遗传学研究的一种重要模式动物，其显著优势在于:斑马鱼体外受精，胚胎在母体外发育且通体透明，因此便于显微观察，受精卵在24 h后其主要的组织器官基本已经发育完全。和老鼠等其他实验动物相比，斑马鱼筛选实验周期非常短，容易诱发和处理大量突变体，可以在显微镜下直接观察到胚胎发育过程。斑马鱼模型已经成功应用于化学诱变、基因插入后大规模基因筛选，增加了基因组文库来源。其神经中枢系统、血液、视觉系统以及内脏器官与人类相应系统有许多共同点。斑马鱼已经成为研究造血系统发育的最佳模式动物，作为脊椎动物它与人类有较高的同源性，同时调节造血系统的分子通路是相当保守的，特别是心血管系统的早期发育过程与人类极为相似，其心血管系统有缺陷的突变体仍然可以长时间存活，这种现象为心血管发育遗传学研究提供了极为有利的条件。例如:gridlock基因突变后引起动脉血管分支受阻，而背部配对的背主动脉正常发育，类似于人类的主动脉狭窄，最后形成中主动脉(midline aorta)，这一过程阐明了人先天性心血管疾病的部分未知病因［2］。
调节臂>集飞行器
脊椎动物发育模式的相似性提示着斑马鱼可以作为人类发育研究的良好模型［3］。其受精卵在28～29℃培养条件下约40 min完成第一次有丝分裂，之后每间隔15 min左右分裂1次;24 h后，其主要的组织器官原基已形成，各个脑室、耳、眼睛、心血管、体节等均清楚可见。胚胎主要从卵黄获得营养成分，维持早期的正常发育，更适合显微镜下观察活体的发育过程。目前已经开展的胚胎发育研究主要包括:母源基因对诱导胚胎发育的影响［4］、胚胎中细胞迁移和粘结的运动机制［5］、原始生殖细胞的起源和迁移［6］、胚胎的诱导与分化［7－9］、脑部及神经系统的发育［10］、体轴的诱导及发育机制［11］、左右不对称发育［12］、各组织器官的发育过程［13］等。
斑马鱼遗传学是一个解析人类基因组的有力系统，大多数已研究的人的基因在斑马鱼都有同源基因。在科研手段上大多涉及基因过量表达、阻断基因表达、利用突变体等。利用反义寡核苷酸阻断基因表达，是人工合成一段啉环修饰的寡核苷酸片段，能够与某个基因的mRNA特异结合，将其注射到受精卵中，它会与该mRNA特异结合从而抑制该mRNA翻译合成功能蛋白［14］，但只是暂时(3～5 d)抑制特异基因的表达;在斑马鱼中要使某个特定基因过量表达，是将已经人工合成的某个特定基因在体外转录成mRNA，然后注射到斑马鱼的受精卵中，在其胚胎发育过程中大量合成该蛋白质，该特定基因过量表达可能影
响某些发育过程而且产生一些明显表型，从而可以了解该基因的可能功能;而产生突变体的方法主要包括化学诱导剂ENU(Ethylnitrosourea)随机诱导突变［15］和结合靶基因筛选的定向诱变，ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，通常是A—T碱基之间的颠换，累积的是单个基因的点突变，ENU的诱变效率非常高，可以达到0.09% ～0.13%［16］，且完全随机突变，故广泛运用于饱和诱变分析斑马鱼功能基因组，通过正向遗传学筛选，可分离突变基因组，到单一功能基因缺陷的突变，脊椎动物体内编码铁输出重要蛋白的保守基因ferroportin1就是在ENU诱导的低素性贫血的突变鱼体内定位克隆得到的;或者利用反转录病毒插入随机阻断或者沉默某个基因mRNA的转录［17］，可以构建斑马鱼任何一个已知基因的突变体，并可以在斑马鱼的传代中将突变基因保存下来;利用转座子插入阻断某个基因的表达［18］，同理，突变体的基因组中某个或者某些基因缺失或者改变，以至于不能合成机体内相应的功能蛋白，最终导致个体或者胚胎出现发育缺陷、畸形甚至死亡，从而探究该基因的生物学功能。
2 人类疾病模型及新药筛选
印度科学家完成野生斑马鱼的全基因组测序，通过比对科学家们发现其基因与人类基因的
相似度达87%，这一发现使得斑马鱼在人类特殊疾病模型和药物筛选中受到越来越多的关注。随着分子生物学和细胞生物学技术的不断发展，也为斑马鱼在人类特殊疾病模型中的运用和发展打下了良好的基础。由于斑马鱼的特点以及与脊椎动物的极大相似性:其血液、内脏器官、神经中枢系统以及视觉系统等，已被广泛应用于人类疾病的研究，主要包括建立人类特殊疾病模型、利用模型进行疾病机理研究和药物筛选等3个方面。
建立人类疾病模型的常用方法有正向遗传法和反向遗传法。目前为止已经有8000多种斑马鱼的突变体，其中有1/4左右成为人类疾病模型，它们可以模拟多种影响人类健康的重大疾病，已经建立的模型包括心血管疾病、造血系统疾病、恶性肿瘤、眼科疾病、神经系统疾病、骨骼相关疾病等［19－22］。例如:抑制flk－GFP转基因斑马鱼节间血管生长的免疫抑制剂麦考酚酸［23］;与人类同源基因具有高度保守性的Phox2b基因和UCH－L1基因分别与神经嵴疾病和帕金森疾病相关，这两个基因的发现为人类在神经嵴疾病和帕金森疾病上的和研究开辟了新的途径［24－25］;人类的霍一奥二氏综合症和斑马鱼突变体heartstrings具有相类似的表型，并且该突变体为霍一奥二氏综合症相关基因的同源基因突变所产生，为该综合症提供了良好的平台［26］;哈佛大学早在10年前就创建了首个斑马鱼白血病模型［27］;而利用致癌物质诱发斑马鱼肿瘤的研究表明，斑马鱼肿瘤在组织病
理和基因组学等方面与人类肿瘤具有高度的相似性［28］，可以用化学诱变剂ENU、γ或X射线照射等方法诱导基因随机突变，通过表型筛选得到具有特定表型的突变基因，同时寻相应的人类基因，建立肿瘤模型，并进行病因和病理研究。斑马鱼人类疾病模型的建立，极大地促进了人类在特殊疾病上的研究及其药物的研制和筛选。
斑马鱼具有繁殖周期短，可以快速获得大量体，胚胎体外发育且透明等一系列优点，使得斑马鱼极其适合于药物先导化合物的筛选［29］。与线虫、果蝇等模式生物相比，斑马鱼的优点在于:它与人类的亲缘关系更近，和人类基因组保守性高，人类的很多基因都能从斑马鱼cDNA中克隆得到，而且蛋白表达具有相似的功能，此外，线虫、果蝇表皮坚硬，药物吸收困难，而斑马鱼胚胎可通过皮肤、鳃、消化系统来吸收药物，药物需要量少;相对小鼠等哺乳动物，斑马鱼体外受精，而且胚胎透明，易于观察药物对活体胚胎内各个组织和器官的作用［30］，避免了杀死或者解剖动物来获取实验材料，使得药物筛选更加快速直观，并且极大地节省了药物筛选的成本。利用斑马鱼建立人类特殊疾病模型，并通过模型对人类疾病的相关基因及功能机理进行深入研究已经发挥了巨大作用。
3 环境毒理学中的研究
目前，水环境污染对人类健康的影响受到越来越多的关注。之前人类对水质环境的检测一直都是局限于用理化方法进行，此方法不仅费时费力，准确度也不高，而鱼类作为水生生物的高级类，处于食物链的顶部，具有很好的代表性，斑马鱼的这些独特生物学特性使其成为环境毒理学研究中的重要实验动物。斑马鱼在进行毒性试验时只需将一定浓度的化学物溶于水体中，实验操作极为方便，尤其是在耗时长的多代生殖毒性试验、慢性毒性试验等试验中突显斑马鱼的优势。如需进行药物和毒物研究，由于其个体小，只需加入微量药剂即可达到实验效果，例如检测对环境中含量极少但具有致癌、致畸以及致基因突变的二恶英类化合物的长期毒性作用研究比采用哺乳动物更显出其优势。随着转基因技术在斑马鱼中的发展，研究者们可以将斑马鱼运用到环境检测当中，如待测水体中存在某些重金属或其他有害物质时，转基因斑马鱼的某些效应原件就会被这些有害物质所激活，针对不同有害物质作用的不同启动子，设计不同的表达荧光蛋白基因，当水体中存在这些有害物质时，转基因斑马鱼就会发出荧光，从而可以快速准确地监测环境中的特定有害物质。随着现代分子生物学研究的进一步深入，利用斑马鱼对人类环境进行预警已经广泛运用到日常检测当中。例如，通过高度敏感的逆转录PCR技术可以检测到基因表达水平中的微细变化，这可能是毒物作用于机体的第一变化指征［31］。在环境污染的研究中人们发现当污
染物作用于机体时，HSPs基因表达会上调，因此，斑马鱼不同的HSPs基因已被运用到环境毒理学的检测当中［32］。
总之，斑马鱼的众多生物学特性决定了其在环境毒理学研究中的独特优势，目前它已广泛地应用于慢性环境毒性试验、环境危险度评价、环境污染物生物累积效应的研究中。通过斑马鱼的生命周期试验可识别和检测环境毒物的作用及评价其潜在毒性。随着分子生物学技术的飞速发展和人类对斑马鱼研究的深入，利用转基因斑马鱼对污染物进行准确、快速、直观的监测将再次掀起斑马鱼在环境毒理学应用中的高潮，并在环境保护领域发挥更大的贡献。
综上所述，目前斑马鱼作为生命科学研究中最重要的脊椎模式动物之一已受到越来越多的重视，并逐渐拓展和深入到生命体的多种系统研究当中，在多门学科中得到广泛运用:发育遗传学、人类疾病研究、环境毒理学以及神经科学等，并不断涌现新的研究成果。随着各种生物技术的飞速发展和对斑马鱼研究的不断深入，相信其在生命科学研究领域中将会发挥更大的作用。汽车钻机
参考文献:
【相关文献】
［1］Streisinger G，Walker C，Dower N，et al.Production of clones of homozygous diploid zebrafish(Brachydanio rerio)［J］.Nature，1981，291(5813):293 －296.
［2］Zhong T P，Rosenberg M，Mohideen M A，et al.Gridlock，an HLH gene required for assembly of the aorta in zebrafish［J］.Science，2000，287(5459):1820 －1824.
［3］Fishman M C.Zebrafish － the canonical vertebrate［J］.Science，2001，294(5545):1290 －1291.
［4］Pelegri F.Maternal factors in zebrafish development［J］.Dev Dyn，2003，228(3):535 －554.
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