目录
（一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16方法简述：双杂交文库的构建和筛选 17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库〔简述〕27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30方法A：通过酵母配对〔Yeast Mating〕来筛选目的蛋白30方法B：通过共转化的方法筛选目的蛋白
35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54
表格列表
Table I．BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II．BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比拟19 Table VI．RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实
验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table I*．双杂交转化的对照实验的设置33 Table *．双杂交配对筛选的对照实验的设置
Table *I．双杂交共转化的对照实验的设置
单人被Table *II．双杂交共转化的对照实验：期望的结果
Table *III．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mi*s
图片列表
Figure 1．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用 4 Figure 2．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用 4
Figure 3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤 5 Figure 4．构建和筛选BD Matchmaker酵母单杂交和双杂交文库 6 Figure 5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因12 Figure 6．BD Matchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选16 Figure 7．BD Matchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选17 Figure 8．用BD SMART技术合成高质量的ds cDNA 21 Figure 9．BD CHROMA SPIN纯化柱和收集管26 Figure 10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库27 Figure 11．为双杂交筛选AD融合文库32 Figure 12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略39 Figure 13．通过酵母配对来验证蛋白-
蛋白相互作用42 Figure 14．用对照用人胎盘Poly A+ RNA合成双链cDNA 51 Figure 15．p53HIS对照载体的图谱53 Figure 16．pGAD-Rec2-53 AD对照载体的图谱53 Figure 17．pGADT7-RecT AD对照载体的图谱54 Figure 18．pGBKT7-53 DNA-BD 对照载体图谱54 Figure 19．pGBKT7-Lam DNA-BD 对照载体图谱55 〔一〕介绍
BD Matchmaker TM Library Construction & Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进展酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BD Matchmaker TM Systems和BD SMART TM cDNA Synthesis的技术，只需要用任何组织的1 μg poly A+ RNA 或total RNA就能构建cDNA文库。通过一般细胞克隆步骤，你能利用BD Matchmaker Systems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进展单杂交或双杂交实验。
单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验
单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA绑定构造域确实定。通过BD Matchmaker One-Hybrid System你可以很容易的获得这些
反渗透浓水基因表达的蛋白
在BD Matchmaker One-Hybrid 实验中，潜在的DNA 绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2〔为单杂交设计的低拷贝载体〕上GAL4激活构造域〔AD 〕序列一起融合表达的。一个或多个目的DNA 序列的串联拷贝被构建在pHIS2〔含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体〕。DNA 绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录〔Figure 1〕，该过程要在宿主菌株Y187〔组氨酸缺陷型〕中进展并在缺少组氨酸的培养基生长
双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理
双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确构造域。在一个BD Matchmaker 双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4DNA 〔DNA-BD 〕绑定构造域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA 与GAL4激活域〔AD 〕序列融合表达〔Fields & Song, 1989; Chien et al., 1991〕。当诱饵与文库融合蛋白在AH109〔ADE2, HIS3, lacZ , MEL1〕这样的报告菌株中相互作用， DNA-BD 和 AD 相接近结合，并激活报告基因转录〔Figure 2)
DNA-BD 和AD 的融合序列是将cDNA 序列克隆进酵母表达载体pGBKT7 和pGADT7-Rec 载体中来实现的。pGBKT7表达了与GAL4 DNA-BD 融合的蛋白，而 pGADT7-Rec 表达与GAL4 AD 相融合的蛋白。在酵母中，两种融合基因在组成型启动子P ADH1下高水平表达的。其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge 基于GAL4的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。pBridge 载体能被用于鉴定三蛋白
复合体的酵母三杂交实验。 双杂和单杂文库的建立和筛选 双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，〔注：有两个步骤遵从同样的流程〕。 如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种DNA-BD 融合载体。第二步是使用试剂盒所提供BD SMART 试剂从你所抽提poly A 和total RNA 建立cDNA 文库。 就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的BD Matchmaker cDNA 文库选取来替代自己准备文库，可以跳过RNA 别离、cDNA 合成、AD 融合文库构建。这些包含非常广泛组织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到Y187酵母菌株。我们也提供一种BD Matchmaker 文库效劳，基于这个效劳，提供应我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作AD 融合文库。请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的BD Matchmaker cDNA 文库，对双杂工作非常理想的，但他们很少适合单杂分析。在单杂分析中我们推荐使用pGADT7-Rec2 and pHIS2等低拷贝载体，因为他们产生较少的假阳性克隆。
其次是cDNA 合成，把cDNA 克隆到BDMatchmaker AD 克隆载体中建立一个GAL4 AD 融合文库，如果是建立双杂文库是pGADT7-Rec 载体，单杂则是pGADT7-Rec2载体。克隆在细胞通过同源重组来进展的，这一步利用酵母替高效重组系统使ds cDNA 和相应的GAL4 AD 质粒融合。采用重组介导的克隆，文库的构建和筛选能严密的完成，而不需要任何的细菌转化和扩增步骤。简单的把cDNA 文库和相应的BD Matchmaker 载体转化到酵母中，然后把细胞用于成分缺省培养基筛选双杂作用。
Figure 3. 酵母单杂和双杂筛选的一般步骤，更加详细单杂和双杂筛选流程图，请参考Figures 6 and 7.
Figure 4. BD Matchmaker TM 单杂和双杂文库筛选与构建.
如这个图表所示，As this diagram shows，重组介导克隆使文库构建和筛选更快捷高效，尽管这里没有显示，双杂文库能通过酵母融合筛选〔细节参照Section *II 〕.BD SMART TM 的cDNA 合成和扩增，请参照Section I*. pGADT7-Rec 被用于双杂文库构建和筛选而pGADT7-Rec2被用于单杂文库构建和筛选。被pGADT7-Rec[2]所显示的两个相关载体有不同复制元件。更多的信息请参照Section * 和相关的载体信息包.i
单杂交和双杂交实验分析的生物学根底 单杂交和双杂交方法是基于许多真核转录因子被发现是复合组成的，它们的转录激活和DNA 绑第构造域在构造上和功能上是分开的。这使研究者可以构建各种融合基因，当在酵母中表达时，能同时结合到目标DNA 序列并激活下游报告基因的转录〔Figure1 和Figure2〕，BD Matchmaker systems 使用的GAL4的转录激活域与DNA 绑定域是被完全阐述的的转录因子〔Zhu, L. & Hannon, G. J., 2000.〕浮游生物计数框
〔二〕试剂盒试剂列表
此试剂盒包含有足够试剂能制备5次单杂或5次双杂文库。
去离子水、BD CHROMA SPIN柱,、NaCl溶液、缺省(DO)补充物、NaOAc、LiAc、PEG、TE Buffer,
、YPD Plus培养基在室温下保存；.酵母菌株、对照Poly A +和BD SMART III Oligo 保存在–70°C，其他试剂储存在–20°C.下。
cDNA第一条链合成
cDNA扩增
Trial –Size BD Advantage TM PCR 试剂盒
cDNA 纯化
单杂交文库构建
双杂交文库构建
BD Yeastmaker 酵母转化系统
〔三〕自备材料
以下试剂自备，无其他特别要求所有的试剂与溶液均储存与室温下。
cDNA第一条链合成电渗析模块
●无菌0.5ml离心管
●Poly A+ or total RNA
●矿物油
●热循环仪
●DNA marker (1-kb DNA ladder)
● 1.2% Agarose/EtBr gel
cDNA的别离
● 1.5ml无菌离心管
●带有小架子环型支架
●95%乙醇〔-20℃〕
●1% 氯代二甲苯
诱饵质粒构建
● E. coli感受态细胞。像DH5α or BD Fusion-Blue 感受态细胞
●T4 DNA连接酶
●10*T4 连接buffer
●LB/amp 平板
●50 mMNaCl
●从E. coli转化子中提取质粒的试剂盒
酵母转化〔在无菌容器中准备试剂〕曲嘉瑞
●PEG/LiAc溶液
● 1.1* TE/LiAc溶液
●二甲亚砜
酵母的培养与配对
●YPD培养基(参照Yeast Protocols Handbook)
●YPDA培养基〔添加30 mg/L adenine hemisulfate，参照Yeast Protocols电插头
Handbook〕
●TE buffer或者无菌的蒸馏水
●适合转化的无菌试管和烧瓶
●100-和150-培养平板
●无菌玻璃棒，用于扑板弯曲的吸管
●*-α-Gal〔用于酵母双杂MEL1表达的蓝白筛选〕
●有agar的Minimal SD Base和没有agar的Minimal SD Base
●3-AT〔抑制SD缺省his培养基背景生长〕
●Kanamycin 储存液〔50 mg/ml 〕保存于-20℃
●Ampicillin 储存液〔50 mg/ml 〕保存于-20℃
文库长期保存
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议