一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的PCR方法

一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的pcr方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的pcr方法。

背景技术：

2.铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)在分类上属假单胞菌科(pseudomonadaceae)、假单胞菌属(pseudomonas migula)。假单胞菌属现有包括荧光假单胞菌(p.fluorescens)、绿针假单胞菌(p.chlororaphis)、恶臭假单胞菌(p.putida)等12个种。铜绿假单胞菌广泛存在于土壤、水、植物及动物活动环境中。人活动场所与医院环境，特别是潮湿污秽的地方，宜于此菌繁殖。在医学领域，铜绿假单胞菌被列入我国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》(2006)，危害程度属第三类。铜绿假单胞菌是一种人畜共患病的机会性病原体，对老年人或免疫功能低下的人和牲畜具有严重的健康风险，可引起各种急慢性感染。铜绿假单胞菌是最重要最常见的条件致病菌，其是医院感染革兰阴性杆菌的常见致病菌。2020年中国细菌耐药监测铜绿假单胞菌超越鲍氏不动杆菌，占非发酵菌首位，占革兰阴性杆菌第三位，耐药率和多药耐药不断攀升以及高病死率，为临床带来极大困惑，进而严重威胁患者生命健康。在兽医领域，铜绿假单胞菌可引起家禽、家畜和宠物的各种急慢性感染，例如中耳炎、乳腺炎、子宫内膜炎、出血性肺炎、泌尿道和生殖道感染等，可发展成致死性腹泻、菌血症和败血症等疾病，极大地危害了动物健康，给动物生产行业造成了较大的经济损失。同时，铜绿假单胞菌及其代谢产生的毒物、废物还可以通过直接接触或食用肉类等方式传播给人体，给人体健康带来了较大的风险。另外，近年来饮水和食用菌栽培生产中假单胞菌的污染与存在状况也越来越受到重视。
3.我们在研究分析环棱螺“腐壳病”的检测过程中发现，在进行选择性平板分离培养致病菌时，铜绿假单胞菌是主要致病菌。根据铜绿假单胞菌的生化特性进行一系列的生化和血清学鉴定的传统方法耗时且工作量大，如果能在选择性平板分离培养后，对疑似铜绿假单胞菌菌落采用分子生物学方法进行铜绿假单胞菌的快速鉴别诊断，无疑将提高环棱螺是否患“腐壳病”的检测工作效率，大大缩短后续生化和血清学鉴定所需的时间、节省人力和物力。目前，针对假单胞菌的分子生物学检测技术研究较为广泛，有多种商品化试剂盒可供选用，但针对铜绿假单胞菌尚无较完善的分子生物学检测手段。本发明提供的一种pcr快速检测鉴定铜绿假单胞菌的方法，将有助于满足医学临床检测工作需要和实际养殖生产中快速检测工作需要，具有重要理论意义和实际应用价值。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种pcr快速检测鉴定铜绿假单胞菌的方法，本发明针对铜绿假单胞菌传统分离鉴定方法无法满足医学临床检测工作需要和无法满足实际养殖生产中快速检测工作需要这些不足开展研究，旨在提供一种快速、灵敏度高、特异性强的检测方法对铜绿假单胞菌进行检测鉴定。
5.本发明通过以下技术方案实现：一种pcr快速检测鉴定铜绿假单胞菌的方法，其特征在于，以dna复制起始调控因子dnaa基因为靶基因，设计引物对铜绿假单胞菌的分子生物学特征进行识别；根据genbank公布的基因序列设计的引物为：
6.上游引物f：5
’‑
atcttctccgcgatgagctg-3’7.下游引物r：5
’‑
cgggttcttcttcagcaggt-3’8.pcr反应体系总体积为25μl，其中2
×
hieff pcr master mix(with dye)(中国yeasen公司生产)12.5μl，上下游引物各1μl，灭菌ddh2o 8.5μl，dna模板2μl；
9.pcr反应循环设置为：94℃，预变性5min；94℃30s，60-64℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸10min，反应结束。
10.优选的，pcr反应循环设置中：退火温度设置为64℃。
11.本发明与传统的分离鉴定的方法相比具有的优势：本发明方法在对铜绿假单胞菌进行检测鉴定中具有快速、灵敏度高、特异性强等特点。本发明为我国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》(2006)中三类病原微生物铜绿假单胞菌的检测和鉴定提供高效的技术手段，同时有助于实现铜绿假单胞菌和其他假单胞菌属细菌的快速鉴别诊断，解决类似背景技术中所述实现对铜绿假单胞菌的快速鉴别诊断的各种实际问题，具有潜在实际应用价值。
12.本发明所提供的一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的pcr方法，具有如下有益效果：
13.1、特异性强：以dna复制起始调控因子dnaa基因为靶基因设计的特异性引物，在pcr试验中仅可扩增出铜绿假单胞菌，而包括希瓦氏菌和枯草芽孢杆菌等在内的9种非铜绿假单胞菌的扩增均为阴性，显示了该引物良好的特异性。
14.2、灵敏度高：用铜绿假单胞菌的基因组dna进行pcr反应，其检测灵敏度可达到32.1pg/μl。
15.3、结果可靠：已经用铜绿假单胞菌多次对引物进行验证，因此可以充分保证结果的可靠性。
16.4、实用性好：根据细菌的生化特性和血清学的传统分离鉴定方法所需检测时间长，本发明采用分子生物学的方法弥补了传统分离鉴定方法的不足，大大减少了检测工作所需时间，为临床因铜绿假单胞菌所引起的各种不适的及时诊断和提供了宝贵的时间。同时，在实际生产中养殖生物的铜绿假单胞菌检疫方面，为铜绿假单胞菌的快速鉴别诊断提供了新方法。
附图说明
17.图1为铜绿假单胞菌pcr引物特异性试验结果。其中，图1(a)中m为2000bpdna梯度标记物(从下往上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp)；nc为阴性对照；泳道1～5均为铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa；图1(b)中m为2000bp dna梯度标记物(从下往上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp)；nc为阴性对照；pc为阳性对照(铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa)；泳道1～9依次为：大肠杆菌eschericha coli；荧光假单胞菌pseudomonas fluorescens；弗德雷里克斯堡假单胞菌pseudomonas frederiksbergensis；枯草芽孢杆菌bacillus subtilis；粘质沙雷氏菌serratia marcescens；嗜水气单胞菌aeromonas hydrophila；维氏气单胞菌aeromonas veronii；中
间气单胞菌aeromonas media；希瓦氏菌属shewanella.sp。
18.图2为铜绿假单胞菌pcr引物最佳退火温度试验结果。其中：m为2000bpdna梯度标记物(从下往上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp)；nc为阴性对照；泳道1～8的温度依次为：50℃、50.9℃、54.2℃、58.8℃、63.7℃、66℃、69.2℃和70℃。
19.图3为铜绿假单胞菌pcr试验最低检测限试验结果。其中：m为2000bp dna梯度标记物(从下往上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp)；nc为阴性对照；泳道1～8的浓度依次为：321ng/μl、32.1ng/μl、3.21ng/μl、321pg/μl、32.1pg/μl、3.21pg/μl、321fg/μl和32.1fg/μl。
具体实施方式
20.结合以下具体实施案例，对本发明做进一步的详细说明，但本发明内容不仅仅局限于以下实施案例。
21.实施例1：铜绿假单胞菌pcr引物特异性试验
22.1.1材料的准备
23.供试菌株如下：铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa；大肠杆菌eschericha coli；荧光假单胞菌pseudomonas fluorescens；弗德雷里克斯堡假单胞菌pseudomonas frederiksbergensis；枯草芽孢杆菌bacillus subtilis；粘质沙雷氏菌serratia marcescens；嗜水气单胞菌aeromonas hydrophila；维氏气单胞菌aeromonas veronii；中间气单胞菌aeromonas media；希瓦氏菌属shewanella.sp。
24.以上所用的菌株均分离自采集广西柳州永乐镇和东泉镇螺蛳养殖基地若干患病环棱螺样本。
25.1.2 pcr方法的建立
26.1.2.1引物的设计合成：基于铜绿假单胞菌的dnaa(编码dna复制起始调控因子的基因)基因序列，通过大量比对及筛选获得高度保守且特异性强的序列用于特异性引物的设计，经ncbi blast比对验证所设计引物的特异性，由北京擎科生物科技有限公司合成。所设计引物序列如下，并针对所设计的引物用温度梯度pcr仪摸索其最佳退火温度，见实施例2。
27.上游引物f：5
’‑
atcttctccgcgatgagctg-3’28.下游引物r：5
’‑
cgggttcttcttcagcaggt-3’29.扩增片段大小为692bp。
30.1.2.2基因组dna提取
31.煮沸法：
32.1、挑取单菌落划线接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基，37℃培养16h-24h；
33.2、刮取1～2接种环菌苔加入150微升灭菌ddh2o中，混匀，100℃沸水浴中煮沸15min；
34.3、10000r/min离心10min，取上清，-20℃保存备用。
35.1.2.3 pcr扩增反应体系：总体积为25μl，2
×
hieff pcr master mix(with dye)(中国yeasen公司生产)12.5μl，上下游引物各1μl，灭菌ddh2o 8.5μl，dna模板2μl。
36.1.2.4 pcr反应循环设置：94℃预变性5min；94℃30s，64℃30s，72℃30s，32个循
环；72℃延伸10min，反应结束。
37.1.2.5 pcr扩增产物检测和鉴定：取6μl pcr产物点样于1.5％琼脂糖凝胶，将琼脂糖凝胶置于1
×
tae缓冲液中用150v电压电泳30min后，取出，置于凝胶成像仪中用紫外灯观察。若在692bp的位置出现扩增条带，则说明所扩增的样品为铜绿假单胞菌。电泳结果显示只有铜绿假单胞菌的pcr扩增产物在692bp的位置有明亮的扩增条带(见图1(a))，用其他非铜绿假单胞菌的dna作为模板进行pcr反应均未观察到有扩增条带(见图1(b))，说明引物的特异性很强。
38.实施例2：pcr引物最佳退火温度筛选
39.2.1材料准备
40.采用实施例1中1.2.2所提取的铜绿假单胞菌dna作为pcr反应的模板。
41.2.2 pcr
42.2.2.1 pcr扩增反应体系：总体积为25μl，2
×
hieff pcr master mix(with dye)(中国yeasen公司生产)12.5μl，上下游引物各1μl，灭菌ddh2o 8.5μl，dna模板2μl。
43.2.2.2 pcr反应循环设置为：94℃预变性5min；94℃30s，应用梯度pcr仪设置8个退火温度50℃～70℃30s，72℃30s，32个循环；72℃延伸10min，反应结束。
44.2.2.3 pcr扩增产物检测和鉴定：取6μlpcr产物点样于1.5％琼脂糖凝胶，将琼脂糖凝胶置于1
×
tae缓冲液中用150v电压电泳30min后，取出，置于凝胶成像仪中在紫外灯下观察。在692bp的位置上均有扩增条带(见图2)，其中泳道1～6扩增条带亮度无明显差异，泳道7和8扩增条带亮度逐渐变弱，同时考虑到适当提高退火温度可以提高特异性扩增，所以退火温度选择为64℃。
45.实施例3：铜绿假单胞菌pcr检测灵敏度试验
46.3.1材料准备
47.采用10倍浓度系列稀释法将实施例1中1.2.2所提取的铜绿假单胞菌dna原液(321ng/μl)稀释成32.1ng/μl、3.21ng/μl、321pg/μl、32.1pg/μl、3.21pg/μl、321fg/μl和32.1fg/μl/μl共7个不同浓度梯度。对连同原液在内的共8个浓度的铜绿假单胞菌dna进行pcr灵敏度试验。
48.3.2 pcr检测
49.3.2.1 pcr扩增反应体系：总体积为25μl，2
×
hieff pcr master mix(with dye)(中国yeasen公司生产)12.5μl，实施例1中1.2.1所述上下游引物各1μl，灭菌ddh2o 8.5μl，dna模板2μl。
50.3.2.2 pcr反应循环设置：94℃预变性5min；94℃30s，64℃30s，72℃30s，32个循环；72℃延伸10min，反应结束。
51.3.2.3 pcr扩增产物检测和鉴定：取6μlpcr产物点样于1.5％琼脂糖凝胶，将琼脂糖凝胶置于1
×
tae缓冲液中用150v电压电泳30min后，取出，置于凝胶成像仪中在紫外灯下观察。若在692bp的位置出现扩增条带，则说明该浓度的样品可以被扩增。电泳结果显示dna浓度为32.1pg/μl时692bp的位置仍然有扩增条带(见图3)，说明此检测方法具有较高的灵敏度，可以达到32.1pg/μl。
52.最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，
均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：

1.一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的pcr方法，其特征在于，以dna复制起始调控因子dnaa基因为靶基因，设计引物对铜绿假单胞菌的分子生物学特征进行识别；根据genbank公布的基因序列设计的引物为：上游引物f：5
’‑
atcttctccgcgatgagctg-3’下游引物r：5
’‑
cgggttcttcttcagcaggt-3’pcr反应体系总体积为25μl，其中2
×
hieff pcr master mix(with dye)(中国yeasen公司生产)12.5μl，上下游引物各1μl，灭菌ddh2o 8.5μl，dna模板2μl；pcr反应循环设置为：94℃，预变性5min；94℃30s，60-64℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸10min，反应结束。2.如权利要求1所述的一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的pcr方法，其特征在于，pcr反应循环设置中：退火温度设置为64℃。

技术总结

本发明提供了一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的PCR方法，所述方法采用上游引物F：5

技术研发人员：

张灿灿 李艳和 石瑞雪 张丹丹 袁振东 文衍红 王志强 罗福广

受保护的技术使用者：

华中农业大学

技术研发日：

2022.09.15

技术公布日：

2022/11/18