疏水性多肽合成与纯化

疏水性多肽合成纯化研究

1. 前言

在固相多肽合成（SPPS）中，多肽的溶解性是合成和纯化过程中的主要问题。如果在合成过程中肽形成如α-螺旋、β-折叠这些二级结构，会使肽溶解性变差，促使肽链聚集，导致氨基酸偶联不完全，形成缺失肽。肽链的聚集这种情况在合成和纯化过程中都会发生[1,2]。

固相多肽合成发展过程中，人们提出了很多关于提高多肽溶解性、减少肽链聚集对合成反应的文献。（1）逐步固相多肽合成方法[3]的提出，克服了在液相合成过程中出现的肽链溶解性差的问题；（2）使用增溶性侧链保护基团[4,6]，可以大大抑制肽链在溶液中的聚集倾向，提高偶联反应效率；（3）合成过程中引入假脯氨酸，也可以有效抑制了β-折叠的形成，增加肽链在溶液中的溶解性[5,12]。（4）还有其他如提高反应温度、微波合成等方法也可以促进偶联反应的进行。

多肽通常以酸性水溶液为流动相，用反相HPLC进行纯化。如果粗肽在水或水/乙腈溶液中溶解性好，会有利于纯化的进行。因此，肽链中含有His、Lys、Arg这几种亲水性氨基酸可以增

加肽链在水溶液中的溶解性。相反，如果出现肽链聚集或难溶，粗肽的纯化会受到很大的影响。因此，对于疏水性强的肽，我们需要肽链进行修饰，提高它在溶液中的溶解性。

2. 合成方法优化

2.1 加入增溶性保护基团

2.1.1肽骨架氨基保护基Hmb及其衍生物

HMB

HMB是Fmoc固相多肽合成中一种亚氨基保护基团，该基团在固相合成重复酰化、去保护的循环过程中非常稳定。肽链中引入HMB保护基团，可以使偶联化反应更完全，提高反应效率。合成过程中，游离的氨基酸羧基先跟苯环上2位羟基偶联，然后通过O→N酰基转移偶联到肽链上。其机理如图2。

图1. 肽骨架氨基保护基：Nα-2-hydroxy-4-methoxybenzyl(Hmb)

图2. Hmb保护的肽反应机理图

T. Johnson等[6]使用N-（2-羟基-4-甲氧苯基）基团烫毛机(Hmb)作为肽骨架上的可逆保护基，有效抑制肽链间的聚集，提高困难肽的反应效率。他们在选定的肽序中引入了N,O-bis-Fmoc-N-(2-hydroxy-4-methoxybenzyl)保护的氨基酸，然后用六氢吡啶/DMF溶液脱去HMB和肽

链氨基上的Fmoc，游离的氨基酸上的羧基先与酚羟基反应，再通过O→N转移与肽链中的氨基偶联。这样不但可以增强氨基酸偶联效果，还能抑制β-折叠的形成。

但是使用Hmb保护基团存在一定的缺点：1. 由于该基团在酸性条件下不稳定，用TFA裂解的时候该基团也会脱去，不能得到Hmb保护的粗肽，从而降低了粗肽在溶液中的溶解性。2. 由于Hmb空间位阻较大，除了Gly和Ala外，其他氨基酸的偶联速度都比较慢。

AcHmb

由于Hmb保护基团在酸性条件下不稳定，用TFA裂解的时候该基团也会脱去，不能得到Hmb保护的粗肽，从而降低了粗肽在溶液中的溶解性。要解决这个问题，人们对Hmb中的2-羟基进行了修饰。AcHmb是在Hmb保护基的羟基上引入了乙酰基，修饰后的AcHmb在TFA裂解时要比Hmb基团稳定。

图3. 肽骨架氨基保护基AcHmb

M. Quibell等[2,7,8,9]在这方面进行了尝试，他们在合成疏水性的β-淀粉蛋白（1-43）中使用Hmb保护的Gly、Phe等氨基酸，肽链偶联完后用乙酸酐和DIPEA在DMF中对Hmb进行乙酰化反应，然后用TFA裂解后得到AcHmb保护的粗肽，最后成功的合成并纯化了该难溶的蛋白质。使用这种方法消除了肽链聚集的倾向，大大的增加了肽链的溶解性，有利于肽的纯化。

图4. AcHmb保护的肽模型图

2,5-Hnb和Hnb

对于一些含有β-支链氨基酸的困难肽，使用Hmb作为保护基时，由于O→N转移效率较低，从而限制了合成效率。基于这种情况，Les P. Miranda等[10]提出了使用网带窑2,5-Hnb和Hnb作为氨基保护基，可以提高O→N转移效率，从而提高了含有侧链功能基和β-支链氨基酸的偶

联反应效率。

图5. 保护基Nα-2-hydroxy-6-nitrobenzyl (Hnb), Nα-2-hydroxy-5-nitrobenzyl (2,5-Hnb)

表1. Hmb, Hnb和2,5-Hnb保护下氨基酸的偶联效率比较

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		Nα-(auxiliary)Val-Ala-Gly-Phe Nα-acylation yield(%)
auxiliary	t (h)	glycine	phenylalanine	valine
1 (HMb)	1	65	4	NDa
	6	72	17	<1
	24	77	t恤制作54	23
2 (2,5-Hnb)	1	>98	37	11
	6	>99	91	42
	24	>99	97	95
3 (Hnb)	1	66	38	31
	6	87	86	75
	24	94	94	93

a ND indicates Nα-acylation product not detected

Les P. Miranda等人使用Hnb保护基方法合成和困难肽STAT-91(699-709)：TGYIKTELISV。图5是各个氨基酸残基的偶联效率曲线图，

图6. 使用Hnb保护基与没有使用保护基的氨基酸残基偶联效率比较

2.1.2.侧链保护基

聚乙烯乙二醇

Mutter, M等[4]提出了在疏水性肽模型Ac-[Lys(R)Val]n-NH的链末端(Ⅱ)、链中间(Ⅲ)和每个Lys中(Ⅰ)分别引入增溶性的聚乙烯乙二醇基团。作为对比，他们在肽模型的所有Lys上接上Ac(Ⅳ)。实验证明，由于肽链Ⅳ在反应中形成二级结构，在较高的反应温度下氨基酸也不能偶联完全。相比之下，肽链上只要连上一个聚乙烯乙二醇基团，就可以增加肽链在溶液中的溶解度，抑制肽链在溶液中的聚集倾向，促进了肽链增长反应的进行。

Ⅰ:	Ac-[Lys(P)-Val]n-NH2	Ia: n = 5; Ib: n = 6
Ⅱ:	Ac-Lys(P)-Val-[Lys(Ac)-Val]3- Lys(P)-Val-NH2
Ⅲ:	Ac-[Lys(Ac)-Val]2-Lys(P)-Val-[Lys(Ac)-Val]2-NH2
Ⅳ:	Ac- [Lys(Ac)-Val]4-NH2
Ac = Acetyl; Lys = lysine; Val = valine; P = poly(ethylene glycol) monomethyl ether

图7. 肽模型图

2.2. 引入假脯氨酸

困难肽合成过程中，由于肽链增长过程中会形成分子内或分子间氢键，导致二级结构形成，影响肽链的合成。但人们发现当肽链中有脯氨酸存在时，肽基本上可以成功合成出来。这是因为脯氨酸中有一个的环结构，这种结构可以阻碍分子内氢键形成，破坏肽链的二级结构。因此，研究人员提出了使用假脯氨酸二肽用于困难肽的合成。

后来，Torsten Wo1hr等提出了用Ser, Thr, Cys等氨基酸合成与脯氨酸结构类似的假脯氨酸[5,11]。合成路线如图4所示。

图4 假脯氨酸合成机理

Ser, Thr, Cys与醛或酮进行环化反应可以得到假脯氨酸。在TFA裂解下，假脯氨酸发生开环反应，还原成原来的氨基酸。

在肽序中引入假脯氨酸，可以破坏链增长过程中形成的如β-折叠等二级结构，从而增加肽的溶解性以及增强反应动力学。假脯氨酸很容易通过Ser, Thr, Cys成环得到，可以作为可逆增溶性保护基团，应用于所有肽合成策略中。

W.R.Sampson等[12]分别在困难肽合成过程中分别引入Hmb和假脯氨酸作为保护基团，对比它们对困难肽合成的影响，数据如表1所示。研究发现Hmb和假脯氨酸这两种基团都可以抑制分子内和分子间氢键形成，提高肽的反应效率，最终提高了粗肽的纯度。

表2. 不同实验方法实验数据对比

tm2005

Peptide	Sequence	Molecular weight	Synthesis method	% Purity by HPLC
1	H-MEDSTYYKASKGC-NH2	smdv-17 1481.7	Standard	27
2	H-MEDSTYYKASKGC-NH2	1481.7	Hmb	39
3	H-MEDSTYYKASKGC-NH2	1481.7	Pseudoproline	45
4	H-MEDST(PTyr)YKASKGC-NH2	1561.1	Standard	25
5	H-MEDST(PTyr)YKASKGC-NH2	1561.1	Hmb	50
6	H-MEDST(PTyr)YKASKGC-NH2	1561.1	Pseudoproline	54
7	H-PKYLQNTLKLATGMRNVPEKQTT-OH	2646.4	Standard	24
8	H-PKYLQNTLKLATGMRNVPEKQTT-OH	2646.4	Hmb	43
9	H-PKYLQNTLKLATGMRNVPEKQTT-OH	2646.4	Pseudoproline	78

同时，他们发现使用在肽链中引入假脯氨酸的合成效果优于使用HMB作为保护基的合成效果，这可能是由于HMB保护的氨基酸偶联速度较慢，氨基酸偶联不完全导致合成粗肽纯度较低。

本文发布于:2024-09-24 06:24:46，感谢您对本站的认可！

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