蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。 （1）原理
（2）分类
①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈 （3）主要试剂
（4）主要程序
（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的
问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类
①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，
原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
（3）主要试剂
伸缩式雨棚
1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和
1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
铂钛催化剂
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀
释到100ml终体积。过滤后40C 保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05g Tris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
木纤维袜子6.1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 3
2ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L 甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。PH8.3
9、1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
10S 2g 三30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S 使用液。使用后应予以废弃。
11
12、
13、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
14、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
15、过氧化物酶标记的第二抗体。
硬质合金丝锥16、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
17、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
18、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
19、 100mmol/L NaCl。
20、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
（4）主要程序
这主要列举了一些网站上有关Western Blot的英文资料，读者可以根据自己实验室的实际情况进行调整：
Western Blot PROTOCOL：
1、Preparation of Brain Membrane Fractions for Western Blot
2、Western Blotting
3、Western Blots
4、Western Blotting
5、General Western Blot Protocol 6 、Western Blot & Immunostaining
7、Western Blot Analysis for Tissue 8 Western Blotting
9、ECM Protocols Western Blot 10、Western Blotting Using Chemilμminscence
11、Far Western Blotting 12、Enzyme-Assisted Immunoelectroblotitng
13、Western Trouble Shooting 14、Too Many Bands on Western Blot
Tips and hints for the storage of antibodies免烧砖机模具
（5）实验常见的问题指南
根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：
1. 参考书推荐
A. 对初学者看什么资料比较好？
解答：《抗体技术实验指南 a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题
B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
解答：怀疑是样品问题，可能是：12Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
C. 细胞水平要做Western Blot，多少细胞提的蛋白够Western Blot？
解答：一般地5* 106就足够了。
Western Blot有无影响?
解答：能，没有问题，我们做过。
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F.
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜变淡了，有什么办法可以解决？薄荷棒
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？
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