Western-Blotting实验报告
Western Blotting
本次试验的⽬的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定⽬标蛋⽩的原理和熟悉Western Blotting的⽅法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。 Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，⽽后利⽤相应的探测反应来检测样品的⼀种⽅法。1975年，Southern建⽴了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利⽤DNA－RNA杂交检测特定的DNA⽚段的⽅法，称为Southern印迹法。⽽后⼈们⽤类似的⽅法，对RNA和蛋⽩质进⾏印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋⽩质分⼦的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋⽩质分⼦的印迹分析称为Eastern印迹法。Western既可以定性，⼜可以半定量，是初步鉴定蛋⽩质最⽅便也是最通⽤的⽅法。它通常分为两种⽅法： 同时Western⼜具有多种识别蛋⽩质的显⾊⽅法，主要有以下⼏种：i. 放射⾃显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈⾊现常⽤的有底物化学发光ECL和底物DAB呈⾊。
⼀、实验原理
Western Blotting（蛋⽩质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋⼒的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。以固相载体上的蛋⽩质为抗原，与之对应的第⼀抗体发⽣免疫结合反应，⼀抗再与酶或同位素标记的第⼆抗体发⽣免疫结合反应，经过底物显⾊活放射⾃显影以检查电泳分离的提议⽬的蛋⽩成分。蛋⽩质印迹技术结合了凝胶电泳分辨⼒⾼和固相免疫测定特异性⾼、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进⾏鉴别和定量检测。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维⽹孔结构(凝胶）。据有⽆浓缩效应可将电泳分为两类：
i.连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒⼦靠电荷及分⼦筛效
应区分。
ii.不连续系统：缓冲离⼦成分、pH值、凝胶浓度不同，带电粒⼦在电场中由电效应、分⼦筛效应、浓缩效应区分。
SDS-PAGE的原理是：依靠SDS带有⼤量负电荷来掩盖蛋⽩质表⾯的净电荷：同时由于在电泳溶液中加⼊了SDS和巯基⼄醇，因此它还可以改变蛋⽩质构象：
在实验中要注意：印迹法需要较好的蛋⽩质凝胶电泳技术，是蛋⽩质样品达到良好的分离效果，⽽且要注意胶的质量，是蛋⽩质容易转移带固相⽀持物上，另外蛋⽩质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物阶段不丢失和扩散。免疫印迹分析之需要很⼩体积的时间，较短的时间过长，操作容易，适⽤于理论和应⽤上的研究。
本实验采⽤⼈⾎清为材料，⼈类Ig根据其重链稳定区的分⼦结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中IgG占⾎清免疫球蛋⽩总量的75%～80%。⼈的IgG由两条重链和两条轻链组成，它们之间以⼆硫键相连。在加SDS 的电泳条件下，分⼦中的⼆硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。对此样品进⾏SDS聚丙烯
酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，⽤电转移法将蛋⽩质转印到硝酸纤维素薄膜上，⽤兔抗⼈IgG为第⼀抗体，⽤辣根过氧化酶标记的⽺抗兔IgG 为第⼆抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测⼈的IgG。
水塔水位控制器⼆、试剂，器材和实验材料
【试剂】
1.30％丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸⽔
⾄100ml。
2.浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。
3.分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。
4.10％过硫酸铵(w/v)：临⽤前⽤蒸馏⽔配制。
5.10％SDS(w/v)。
6.10％TEMED。
7.电极缓冲液：⽢氨酸11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加⽔⾄800ml，pH8.3。
8.样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8，20％⽢油，4％SDS，10％
巯基⼄醇，0.005％溴酚兰。
9.考马斯亮蓝R250染⾊液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%⼄醇，10%冰⼄
酸。
10.脱⾊液：⼄醇6ml，冰⼄酸2ml，加⽔⾄20ml。油田加药装置
11.TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/L Tris-HCl,
12.500mmol/L NaCl，pH7.5，每组配150ml。
13.TTBS：取100mlTBS，加250µl 20％Tween-20。
14.封闭液及抗体稀释液：3％脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。
15.底物溶液：2.5mg⼆氨基联苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10µl H2O2，临⽤
前配制。
16.考马斯亮蓝R250染⾊液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%⼄醇，10%冰⼄
酸，总体积500ml。
17.脱⾊液：⼄醇6ml，冰⼄酸2ml，加⽔⾄20ml。
透射电镜制样【器材】
1.夹⼼式电泳槽
2.转移电泳槽
3.电泳仪
【实验材料】
1.⼈⾎清门铃电路
2.硝酸纤维素膜
三、实验步骤
网眼袋
ⅠSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.灌胶前的准备：将两块玻璃板洗净晾⼲或⽤吹风机吹⼲，嵌⼊本体的
凹槽中，长玻板朝外，短玻板朝内，两块玻璃板之间就形成了凝胶室。合上滑块，拧螺栓锁紧凝胶室，检查凝胶室底部是否与本体底端重合。然后将以上组合放⼊制胶架，插⼊并旋转凸轮，即可灌胶。
2.配制胶液
3.灌胶：将配制好的分离胶液倒⼊两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加
⾄距短玻璃板顶端约1.5cm处时停⽌灌胶，然后在胶液表⾯上⼩⼼加⼊厚约0.5cm的⽔层，以保持分离胶⾯平整，同时隔绝空⽓，空⽓中的氧对凝胶的聚合有阻碍作⽤。待凝胶和⽔之间出现清晰界⾯时，说明分离胶已聚合，⼤约30min完成聚合。倾去分离胶上层的⽔，将配制好的浓缩胶液加到分离胶上，⾄接近短玻璃板的顶端，插上样品梳，放置待其聚合。4.配制电极缓冲液：⽢氨酸14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加⽔⾄1000ml，
pH8.3。每组配1000ml。
5.制样：5µl⼈⾎清，加45µl⽔，再加50µl加样缓冲液。沸⽔浴加热8
分钟，10000rpm离⼼2分钟，取上清液作为样品。另按说明书制备好蛋⽩质分⼦量标准样品。
6.加样：1、加⼊电极缓冲液；
a) 拔出样品梳；
b）选3个样品槽，⽤微量进样器加样，中间槽加⼊5µl分⼦量标准蛋
⽩样品，两旁槽各加⼊10µl⼈⾎清样品。稳压120V电泳，当溴酚蓝
前沿到达距底部0.5cm左右时，停⽌电泳。
7.切胶：根据切割线，先竖切后横切，宽胶条为两泳道，含⼈⾎清样和分⼦
量标准蛋⽩样，考马斯亮蓝R-250全蛋⽩染⾊。窄胶条为⼀泳道，为⼈⾎清样，转印后对⽬标蛋⽩免疫染⾊。
8.胶条保存：将两个胶条⽤保鲜袋包好，贴上标有⾃⼰名字的标签-20℃冻
存。
Ⅱ转印蛋⽩质到硝酸纤维素膜上
1.将带有⼈⾎清和标准蛋⽩的宽胶带⽤考马斯亮蓝R250染⾊、脱⾊：将宽胶
条放到培养⽫中，⽤蒸馏⽔清洗后，加⼊约10ml考马斯亮蓝R-250染⾊液染⾊1⼩时左右，然后换成脱⾊液脱⾊，不时摇动。更换⼏次脱⾊液，⾄背景⽆⾊透明，条带清晰为⽌。
2.放置NC膜和胶条：
a)⑴.切割与胶尺⼨相符的硝酸纤维素膜，⽤转移缓冲液或⽔浸泡5min使
之湿润。
b)⑵.准备2张滤纸和海绵⼀起浸泡在转移缓冲液中。
c)⑶打开转移转移槽的胶板，依次放⼊：a.⼀张浸湿的海绵b. ⼀张浸湿
的滤纸c. ⽤转移缓冲液冲洗过的胶，并⼩⼼地赶⾛滤纸和胶之间的⽓泡
d. 硝酸纤维素膜，在膜的右下⾓剪⼀⼩⾓，以标明电泳⽅向
e. ⼀张浸
湿的滤纸f. ⼀张浸湿的海绵。
3.转移：⼩⼼地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的⽅向放⼊转移电泳
槽中，加转移缓冲液⾄满。插好转移电泳装置的电极，打开电泳仪开关调⾄稳压60V，电泳1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。
Ⅲ膜的酶联免疫染⾊
1.封闭：⽤TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封⼊塑料薄膜袋内，留⼀开⼝。加
封闭液1ml后封闭开⼝，37℃摇床上摇动30min。
2.加封闭液及抗体
a)与第⼀抗体结合
(1)弃封闭液，加⼊适当稀释的1ml第⼀抗体溶液(兔抗⼈IgG)，封⼝
后37℃摇床上轻轻摇动50min。
(2)取出膜，⽤TTBS洗膜3次，每次1min。再封⼊⼀新的塑料薄膜袋
内。
b)与酶标第⼆抗体结合
(3)加⼊适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记⽺抗兔IgG，37℃摇床上
轻轻摇动50min。
(4)取出膜，⽤TTBS洗3次，每次1min，最后⽤TBS溶液洗1次，
以去除Tween-20。
加底物溶液显⾊
将膜浸⼊10ml底物溶液中，⾄显⾊清楚后，⽤⽔清洗，以除去多余的底物。转⼊⽔中保存。
3.结果分析：在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果。测量分⼦量标准蛋⽩
的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的⼈IgG带的迁移距离，在标准曲线上查出⼈IgG重链的分⼦量。
实验结果：
做标准蛋⽩曲线的的凝胶的总长为7.53cm
带有⼈⾎清IgG的硝酸纤维素膜的总长为7.24cm
由公式y = -1.1451x + 2.0366知：
当x（重链相对迁移率）=0.33时，y=1.6587 得IgG重链相当分⼦量为：45.57KDa
当x（轻链相对迁移率）=0.56时，y=1.3953 得IgG轻链相当分⼦量为：24.85KDa
讨论：
⼀、实验注意事项：
恒温室1..丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有神经毒性，注意不要沾在⽪肤上，如有沾染可
⽤⽔洗净。聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。
2.电泳槽只能⽤⽔冲洗，不能⽤刷⼦刷，以免刷断铂电极丝；注意保护玻璃板。
3.⼀抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。多克隆抗体结合抗原能⼒较
强、灵敏度⾼，但易产⽣⾮特异性的背景；单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性⽽失去了空间构型的抗原表位，且易发⽣交叉反应。因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推荐，它是由⼀组能与抗原分⼦中的不同且不易变性的抗原表位结合
并不易出现交叉反应的单克隆抗体混合构成。
4..如果反应灵敏度不⾼，可增加凝胶的厚度到1.5mm（厚度超过2.0mm时，
凝胶转移效率受限）；也可在电泳条带不发⽣变形的前提下，尽量提⾼蛋⽩样品的上样量。
5.滤纸/凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在⽓泡，可⽤玻璃棒在夹层组合上
滚动将⽓泡赶出，以提⾼转膜效率；上下两层滤纸不能过⼤，避免导致直接接触⽽引起短路。
6.如果出现⾮特异性的⾼背景，可观察仅⽤⼆抗单独处理转印膜所产⽣的背景
强度，若⾼背景确由⼆抗产⽣，可适当降低⼆抗浓度或缩短⼆抗孵育时间；
并考虑延长每⼀步的清洗时间。
7.⼀抗与⼆抗的稀释度、作⽤时间和温度对检测不同的蛋⽩要求不同，须经预
实验确定最佳条件。
8.⼀般情况使⽤0.45µm的NC膜，0.1～0.2µm的⼩孔径膜只适合于分⼦量
⼩于20kD的蛋⽩质。
⼆、实验思考题：
1.12%的分离胶适合分离多少分⼦量范围的蛋⽩质？
答：由《分⼦克隆》中的分离胶浓度与蛋⽩质分⼦量线性关系图知，12%的分离胶适合分离分⼦量范围在15-60KDa的蛋⽩质。
2.电极缓冲液中⽢氨酸的作⽤?
答：SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/⽢氨酸，电泳开始后，HCL解离成氯离⼦，⽢氨酸解离出少量的⽢氨酸根离⼦。蛋⽩质带负电荷，因此⼀起向正极移动，其中氯离⼦最快，⽢氨酸根离⼦最慢，蛋⽩居
中。电泳开始时氯离⼦泳动率最⼤，超过蛋⽩，因此在后⾯形成低电导区，⽽电场强度与低电导区成反⽐，因⽽产⽣较⾼的电场强度，使蛋⽩和⽢氨酸根离⼦迅速移动，形成以稳定的界⾯，使蛋⽩聚集在移动界⾯附近，浓缩成⼀中间层。
3.不加封闭液会产⽣什么样的结果？
答：在实验中加封闭液的作⽤是防⽌NC膜上没有蛋⽩质的地⽅粘上⼀抗，否侧经底物显⾊反应后，整个NC膜都会背上⾊，⽆从辨别实验蛋⽩。故需不与⼀抗、⼆抗识别的⾮特异蛋⽩质提前占位。
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