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李晴;胡丽红;曲波
【摘 要】目的 对比研究不同浓度葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型,从不同角度监测炎症反应程度,为实验造模提供理论数值,并选择最佳的造模方案.方法 用BALB/C小鼠自由饮用DSS溶液的方法建立低浓度(3％)和高浓度(5％)模型组,正常对照组饮用蒸馏水,每组24只.分别于第0天、3天、7天对小鼠进行动态观察:疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠组织病理学改变、血清中HGB、CRP、TNF-α的表达、结肠黏膜中MOP、SOD、NF-κB的表达及NF-κB核转位情况、绘制小鼠生存曲线.结果 HGB、SOD与UC疾病活动程度呈负相关,CRP、TNF-α、MOP、NF-KB与UC疾病活动程度呈正相关,均表现出明显的时间和剂量依赖性.结论 随着造模浓度和时间的增加,小鼠模型UC的炎症程度也逐渐加重,但死亡率也随之增加,得出3％ DSS溶液喂养7d建立的UC小鼠模型为最佳. 【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》
【年(卷),期】2016(025)010
【总页数】5页(P1106-1110)
【关键词】葡聚糖硫酸钠;小鼠;溃疡性结肠炎;造模
【作 者】李晴;胡丽红;曲波
【作者单位】哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科,黑龙江哈尔滨150086;哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科,黑龙江哈尔滨150086;哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科,黑龙江哈尔滨150086
【正文语种】中 文
【中图分类】R574.62
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种病因和发病机制尚不明确的慢性非特异性肠道炎性病变，发病率在我国逐年上升,其发病机制并不明确，也缺乏特异性方法，成为近些年消化领域的热点。n0705
葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)诱导的小鼠UC模型的肠道病变与人类UC肠道
病理形态变化最为相近[1]，因此被广泛应用。目前较为常用的造模DSS溶液浓度为3%和5%[1-3]，部分研究[4-5]以疾病活动指数(disease activity index, DAI)对小鼠进行评估，发现DAI评分随着DSS溶液浓度呈线性增加。本文将通过更全面的实验指标检测，并对与UC发生、发展相关的核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)[6]在UC小鼠结肠黏膜中的表达及激活情况进行比较，以便指导我们选择更优的方式建立UC小鼠模型。
1.1 材料
1.1.1 动物：雄性BALB/C小鼠，体质量25～30 g，常规喂养，由哈尔滨市附属第二医院动物实验中心提供。
1.1.2 主要试剂：DSS(M.W.=36 000～50 000，上海翊圣生物科技有限公司)；MPO测定试剂盒、SOD测定试剂盒、ELISA试剂盒(北京义翘神州生物科技有限公司)；EMSA试剂PIERCE公司；其他试剂为进口或国产分析纯。
1.2 分组 72只BALB/C小鼠随机分为正常对照(蒸馏水)组、低浓度(3%)组和高浓度(5%)组，每组24只，各组内又随机分为0 d、3 d、7 d 3个小组(8只/组)。
1.3 实验观察
1.3.1 一般状态：动态观察小鼠体质量、大便性状及便血情况，根据表1进行DAI评分[7]，并分别于第0天、3天、7天3个时间点对小鼠进行相关实验指标检测。
1.3.2 血液化验：摘眼球取血，将血液静置离心(3 500 r/min)10 min，取血清，分装后置-20 ℃冰箱保存，实验结束后，一部分统一于相关实验室测定血红蛋白(hemoglobin, HGB)、C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)含量。
1.3.3 TNF-α检测：另一部分静脉血应用ELISA法严格按照试剂盒说明书统一测定肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的表达，以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，根据样品的OD值由坐标曲线查出相应的浓度，然后乘以稀释倍数进行计算。
1.3.4 MPO与SOD的活性测定：处死小鼠后取结肠标本，第一部分以4.0%多聚甲醛固定，石蜡包埋后行4 μm厚度切片，HE染光镜下观察组织病理学形态；第二部分用以测定髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活
性，冰1×PBS冲洗，冻存于液氮中，测定时从液氮中取出结肠组织，称重，剪碎，以冰生理盐水作匀浆介质，玻璃匀浆器冰上匀浆成10%匀浆液，其他操作步骤根据试剂盒要求，做相应处理后测定吸光度，计算相应的MOP、SOD活性。
1.3.5 NF-κB的表达：组织以免疫组化方法测定NF-κB的表达，显微镜下，细胞浆和细胞核内出现棕黄颗粒的细胞为NF-κB P65阳性细胞，在40倍高倍镜下选取典型视野计数1 000个细胞，其中阳性细胞数作为NF-κB P65计数值，并以百分率表示。
1.3.6 NF-κB的活化情况：检测NF-κB核转位情况，采用EMSA方法，活化的DNA结合蛋白可与特定序列的DNA探针结合形成DNA-蛋白复合物而使其电泳迁移率显著减慢，于是在胶片或成像系统上出现较游离条带滞后的新条带，根据滞后条带的强弱对样品中的DNA结合蛋白(NF-κB)活性进行半定量分析。
1.4 统计学处理 采用SAS 9.1.3软件进行统计分析，本研究采用析因设计的方差分析，同时分析给药时间和药物浓度两个因素的主效应和交互效应。计量资料以表示；多样本间两两比较采用Bonferroni检验；检测指标的相关性采用多变量关联性分析，相关系数采用Spearson相关系数。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 一般情况 正常对照组小鼠生长良好，无明显变化；低浓度组第3天出现半稀便，便潜血阳性，此后逐渐出现体质量减轻、稀便、肉眼血便；高浓度组第2天即出现便血，体质量减轻明显(见表2)。此外，低浓度组3 d小鼠无死亡，高浓度组3 d小鼠死亡1只；低浓度组7 d小鼠死亡1只，高浓度组7 d小鼠死亡3只，高浓度组小鼠生存率明显低于低浓度组(见图1)。
2.2 病理形态学观察 正常对照组小鼠结肠未见明显病理改变。随着DSS浓度及实验天数的增加，可见炎性细胞浸润的程度随之增加，逐渐出现结缔组织坏死，黏膜上皮细胞随之坏死脱落(见图2)。
2.3 血液指标检测结果 血液中HGB的表达与UC疾病活动程度呈负相关(F=434.05,P<0.0001)，CRP的表达与UC疾病活动程度呈正相关(F=308.01,P<0.0001,见表3)。
2.4 TNF-α在UC模型中的表达 实验中随着DSS溶液浓度及实验天数的增加，TNF-α的表达与UC炎症程度呈正相关(F=3655.50,P<0.0001,见表4)。
2.5 MPO与SOD的活性测定 MPO与UC疾病活动呈正相关，SOD与UC病情活动程度呈负相关(见表5)。
2.6 NF-κB的表达情况 正常对照组、0 d低浓度、高浓度组几乎无NF-κB的表达；3 d、7 d高浓度组的表达明显高于低浓度组；而无论低浓度组还是高浓度组，7 d较3 d浓度组的表达均升高(见表6、图2)。
电话计费系统2.7 NF-κB核转位情况 通过EMSA方法分析，形成的新条带由强到弱的顺序分别为7 d高浓度组、7 d低浓度组、3 d高浓度组、3 d低浓度组(见图3)。
由于UC的病因不够明确，上也缺乏特异性的药物，对UC患者造成相当大的困扰，世界卫生组织将其列为难治性疾病之一。因此选择合适浓度的DSS溶液建立更为标准的UC小鼠模型，对今后UC发病机制的研究及新药物的开发显得尤为重要。
目前建立UC模型的化学方法有很多种，例如乙酸造模法、角叉菜胶造模法、DSS造模法、NaOONO2造模法、TNBS造模法、DNCB造模法等，但每种造模方法都不尽如人意，通常存在操作复杂、造模成功后自愈性强、成本高等缺点，但近年DSS造模法应用最广泛，因其模型临床症状、病理表现、疾病预后转归与人UC最为相似[1]。
本研究实验初期(0 d)，我们对每一组检测指标均进行了相关性分析(P>0.05)，从而保证了实验基线水平的一致性；同样对3 d、7 d的检测指标也进行了相关性分析，各检测指标的相关性都很强(P<0.05)，实验结束后，我们应用3×3析因设计检测各指标给药时间和给药浓度的主效应和交互效应(P<0.05)，可以认为不同给药时机、不同给药浓度对UC小鼠模型都有影响，在一定范围内，给药时间越长UC小鼠模型越好，给药浓度越高UC小鼠模型越好。最后在总体有统计学意义的基础上对各个检测指标进行两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。
水塔水位控制系统NF-κB是一种具有多向转录调节作用的蛋白质，参与许多疾病的发病机制[8-10]。正常状态下，NF-κB家族成员通常以二聚体形式与其抑制蛋白IκB形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中。在各种活化因素的作用下，IκB蛋白激酶IKK活化，IκB被磷酸化并通过26S蛋白酶体顺序降解，与NF-κB解离，NF-κB活化进入细胞核内,其DNA结合位点暴露，与DNA启动子上特定的认知序列结合,调控NF-κB反应性基因的转录。在UC中，活化的NF-κB可调节与UC发生、发展相关的促炎性细胞因子，如TNF-α等的产生和释放，加重肠道的炎性反应[6,11]。由此提示NF-κB的激活在UC免疫调节及炎症反应中起关键作用。在以往的实验中[12-13]已经得到证实，随着UC动物模型炎症程度的增加，肠组织中NF-κB的表达随之增强，
核转位随之活跃，本实验也得出了一致的结论。
从整体实验中可以看出药物浓度高、给药时间长的UC模型各项实验指标的变化与UC炎症变化更为接近，但是动物模型的建立是后续实验的基础，需综合考虑模型的死亡率，因此结合小鼠生存曲线，本实验得出3%DSS溶液喂养7 d建立的UC小鼠模型为最佳。
氧气调节阀【相关文献】
[1]Okayasu I, Hatakeyama S, Yamada M, et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice [J]. Gastroenterology, 1990, 98(3): 694-702.
[2]Zhang DK, Yu JJ, Li YM, et al. A Picrorhiza kurroa derivative, picroliv, attenuates the development of dextran-sulfate-sodium-Induced colitis in mice [J]. Mediators Inflamm, 2012, 2012(2): 751629.
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