拟南芥abf3和abf4突变体对ABA和盐胁迫响应

刘帅;朱明鲲;刘旭;李玲

【摘要】研究拟南芥abf3、abf4突变体和野生型(Col)对ABA和盐胁迫的响应.结果表明:与野生型相比,abf3对ABA的敏感性显著下降.盐胁迫下,abf3、abf4突变体的绿胚率、叶绿素含量、黄化率均低于Col,abf4根长比高于Col,abf3与Col无显著差异,说明ABF3、ABF4对盐敏感性高于Col,ABF4更为显著.以上结果初步显示:拟南芥同源基因ABF3和ABF4在对外施ABA和盐胁迫响应中发挥不同的作用.%The responses to exogenous ABA and salt stress in ABF3 - and ABF4 - related mutants of Arabidopsis thaliana were investigated, by observation of stomatal sensitivity, relative root length, seed germination rate, green cotyledon rate, chlorophyll content and yellowing rate. Our results showed that stomatal sensitivity and relative root length in mutants are lower than those of wild - type in ABA treatment, but germination rates and green cotyledon rates are higher, and the sensitivity to ABA of abf3 is significantly lower than the wild - type. In the salt treatment, green cotyledon rate, chlorophyll content and yellowing rate in mutants are all lower than the wild - type, and the r视觉定位系统

elative root length of abf4 is higher than the wild - type, which means that abf3 and abf4 are more sensitive to salt stress than wild - type and the sensitivity of abf4 is significantly higher. The preliminary results show that abB and abf4 play different roles in response to exogenous ABA and salt stress in Arabidopsis thaliana.

【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2012(044)004

【总页数】5页(P100-104)

【关键词】ABF突变体;ABA敏感性;盐胁迫;干旱

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【作者】刘帅;朱明鲲;刘旭;李玲

【作者单位】华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育生物工程重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育生物工程重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育生物工程重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育生物工程重点实验室,广东广州510631

【正文语种】中文

【中图分类】Q789

台风实时监控系统ABF是一类AREB类转录因子，可以与ABA诱导基因的启动子区域结合调节下游靶基因的表达［1］．2000 年，UNO 等［2］和 CHOI等［3］分别从拟南芥中分离出4种bZIP蛋白，其中ABF1主要参与低温、ABA胁迫的应答反应;ABF3主要受 ABA、高盐、低温、热、氧化胁迫诱导;ABF2/AREB1、ABF4/AREB2则主要参与ABA、干旱、高盐、热和氧化胁迫应答反应［2］．AREBs转录因子特异存在于植物中，超表达和abf4突变体植株，分析它们对ABA和盐胁迫响应特点，揭示ABF3和ABF4的功能差异，为深入研究ABF在ABA信号途径的作用提供依据．

1 材料与方法

1．1 材料与处理

哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Columbia，缩写为Col)．拟南芥突变体abf3(SALK 127755)和abf4(SALK 069523)购于拟南芥资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，AB

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RC)，经本实验室纯化鉴定．

ABA处理:种子消毒后，播种于含有不同浓度的ABA的1/2MS固体培养基上，4℃放置2 d，然后在光照培养箱中(昼夜温度为22°/20°，光照周期为16 h/8 h，平均湿度为40% ～60%)培养．

盐胁迫处理:种子播种于含有 0、100、200 mmol/L NaCl的1/2MS固体培养基上，4℃同步化处理2 d，然后光照培养箱中(昼夜温度为22°/20°，光照周期为16 h/8 h，平均湿度为40% ～60%)培养．

1．2 试验试剂及PCR引物

Taq DNA聚合酶、RNA提取试剂TRizol、DNase I(RNAase-free)、One Step RT-PCR试剂盒均购自TaKaRa;引物合成和PCR产物测序由上海英俊公司完成，名称及序列如下:2Bd3-LP(ABF4)5’-GGGTTTTAGGGCTTGGATGCT-3’，2Bd3-R(ABF)5’-TTCACAGGCGCAGAAAATGCT-3’，ABF3-F 5’-TTGATGGTGTGAGTGAGCAGC-3’，ABF3-R 5’-TGGCAAGAGTTGGACGTTGTG-3’，LBa1 5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’;其他常规试剂均为国产分析纯．

1．3 试验方法

1．3．1 RT-PCR检测按照 TaKaRa提供的 TR-izol使用方法提取南芥叶片RNA备用，使用one step RT-PCR对基因的转录产物进行基因表达鉴定．程序:50℃逆转录30 min，94℃终止反应2 min，94℃变性2 min，94℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸70 s，28个循环，72℃延伸5 min．质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物．

1．3．2 种子萌发率种子经春比后，在光照条件下培养1 d后，统计萌发率，每12 h统计1次，重复3次．

1．3．3 绿胚率统计种子经光照培养16 d统计绿胚率，重复3次．

1．3．4 根长比率拟南芥在1/2 MS培养基培养至长出2片子叶(约3 d)，点种在1/2MS固体培养基正常板和含质量分数0．8%蔗糖的1/2MS固体培养基上，平板垂直培养8 d，测量主根长度．

1．3．5 气孔开度和开度率测定 3周龄叶片置于气孔开度溶液(KCl 50 mmol/L，CaCl2 50 μmol/L，MES 10mmol/L，pH 6．15)0．5 h，撕下叶片表皮立即放入固定液(V(无水乙醇)∶

V(冰醋酸)=3∶1)中为对照叶片．处理叶片置于含10μmol/L ABA的气孔处理溶液1 h后固定，显微镜下拍照记录结果．

1．3．6 叶绿素含量测定参照李合生等［4］的方法测定和计算叶绿素含量，单位为mg/g．

1．3．7 叶片黄化率统计植株盐处理采用人工浇盐水的方式．选取规格一致的花盆装入质量相同的土，将在光照培养箱中生长至四片子叶的幼苗移栽入土中，每次实验处理中野生系和转基因系均为32株．在第3周，幼苗长到约12片叶时，进行即分别在第1、第 5、第 9 天分别浇 100、200、300 mmol/L 的NaCl溶液0．8 L，处理后第12～15天拍照，统计叶片黄化率．

1．3．8 盐胁迫叶片鲜重减少率统计使用1．3．7中的植株，分别在盐处理第1、15天统计叶片莲座叶子鲜重，统计叶片鲜重变化率．

1．3．9 数据统计数据结果通过Excel 2003分析，T检验双样本异方差分析．

2 结果与分析

2．1 突变体的鉴定筛选

根据abf3和abf4突变体的基因结构图谱(图1 A)为依据合成基因表达鉴定的引物，通过RT-PCR检测突变体中ABF3，ABF4基因表达的电泳图．abf3和abf4突变体株系中相应突变基因在基因表达鉴定中均表达缺失(图1B)，表明基因组鉴定所得的abf3和abf4突变体植株为单基因缺失表达的纯合子，用于后续生理实验．

图1 abf3和abf4突变体的基因结构图谱(A)和分子鉴定(B)Figure 1 Schematic diagram(A)and molecular identification(B)of abf3 and abf4

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2．2 突变体对外施ABA的响应

通讯加密种子在光照条件下培养60 h后，abf3、abf4在没有ABA处理(对照)条件下，其萌发率与Col差别不明显，经 0．1、0．5、1．0 μmol/L ABA 处理的种子，萌发率均高于Col，均表现为对ABA不敏感，说明外源ABA抑制种子萌发通过ABF3和ABF4起作用(图2)．

在正常生长条件下，拟南芥各株系绿胚率均为100%;abf3和abf4经1μmol/L ABA 处理16 d，其绿胚率高于Col(图3A)，abf3绿胚率高于abf4植株，表明abf3和abf4显著降低对ABA

的敏感性，ABF3基因在响应ABA信号途径中所起的作用比ABF4明显．

分析ABA处理12 d后突变体和野生型的根长比率，结果表明，用20μmol/L或50μmol/L ABA处理abf3的根长比率都显著高于Col;而20μmol/L ABA处理的abf4的根长比率与Col没有明显变化，但50μmol/L处理的abf4的根长比率低于Col(图3B)．表明与ABF4比较，ABF3基因的根生长在响应ABA信号途径中起到更关键作用的结果．

abf3、abf4叶片经气孔开放乳液浸泡0．5 h后，其叶片的气孔开度均比Col略大，但无明显差异(图4A)．10μmol/L ABA 浸泡1 h处理的 abf3、abf4气孔开率均比Col大，abf4气孔开率变化仅为10%左右．说明 abf3、abf4的气孔对 ABA的敏感性低于Col．ABF3、ABF4均参与ABA信号通路对气孔开度的调节，其中ABF4可能比ABF3起到更关键作用．

2．3 abf3和abf4突变体对盐胁迫响应

在含100 mmol/L NaCl的1/2MS的培养基培养16 d后，与在正常生长条件培养结果相比，abf3和abf4突变体的绿胚率比Col低，abf3对NaCl的相应程度高于abf4(图5)．在150 mmol/L NaCl处理的abf3根长比率比Col高．当NaCl浓度为200 mmol/L时，abf3的根长比率高于Col，而abf4与Col无明显差异．总之ABF3对NaCl的敏感性．

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