密级：学校代码：10075
杏仁脱皮机
分类号：学号：20091103
理学硕士学位论文
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学位申请人：孙 晗
指导教师：
刘存歧 教授
董小平 研究员
安全传输
石 琦 副研究员
学位类别：理学硕士
学科专业：生态学
授予单位：河北大学
答辩日期：二○一二年五月
Classified Indx： CODE:10075 U.D.C： NO: 20091103
A Dissertation for the Degree of M.Science Roles of disulfide bond in biochemical and functional properties of human
prion protein
Candidate:Han Sun
Supervisor:Prof. Liu Sunqi
Prof. Dong xiaoping
Associate Prof. Shi qi
Academic Degree Applied for :Master of Science
语音调度系统Specialty:Ecology
University:Hebei University
Date of Oral Examination:May, 2012
pigi
摘要
摘要道路交通事故现场图
本研究主要围绕二硫键在人朊病毒蛋白分子huPrP23-231中的作用展开，首先通过体外对纯化的原核重组人正常朊蛋白硫醇基团的氧化还原过程，测定二硫键的改变对其生化特性的影响；进而探究了N端八肽重复区序列对二硫键形成的硫醇基团的氧化还原过程介导的聚集和纤维化的敏感性，最后进行了部分二硫键相关突变体质粒的构建，和真核细胞转染。蛋白沉淀实验显示重组正常人朊病毒蛋白经过硫醇基团的氧化还原过程明显增加了其聚集性，而八肽重复区缺失和插入型突变体蛋白则没有明显变化；硫磺素T(Thioflavin T ，ThT)实验测定发现，经过硫醇基团的氧化还原过程重组PrP蛋白的纤维形成增多，同样的八肽重复区突变体蛋白无明显变化；圆二谱（Circular Dichroism, CD）测定显示，处理后的重组PrP蛋白二级结构发生改变，其β-折叠结构比例显著增多，八肽重复区突变体蛋白的β-折叠则减少；蛋白酶K消化实验也进一步显示硫醇基团的氧化还原后PrP的蛋白酶K抵抗能力有所增加，而八肽重复区突变体蛋白的蛋白酶K抗性增加更明显。这些结果提示二硫键的形成可明显地改变PrP的二级结构，促进朊蛋白聚集和成纤维过程，而且正常的5个八肽重复区序列对蛋白稳定的构象转变是必需的。为进一步研究二硫键的作用，构建了二硫键相关的突变体质粒pQE30-C214G、pQE30-C179G/C214G、pQE30-M166C/E221C，并进行了测序和酶切鉴定。正在进行的和后续实验准备通过原核表达、纯化并进行硫醇基团的氧化还原过程，进行上述参数测定；并且在真核细胞中转 染构建的二硫键相关突变质粒pcDNA3.1-C179G/C214G、pcDNA3.1-M166C/E221C，测定可能引起的细胞毒性和细胞保护作用。
关键词 朊蛋白 氧化还原 纤维化 β-折叠 点突变
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