首页 > 专利信息

7 三点测交法测定果蝇基因重组率

三点测交法测定果蝇基因重组率

摘要

通过选取黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) X染体上的三个基因：白眼（w）、小翅（m）与焦刚毛（sn）基因进行三点测交实验，统计计算非等位基因的重组率，并对照标准基因图谱进行χ2检测，验证其相关性。

引言

广泛用于遗传学研究的果蝇为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) , 属于果蝇科、果蝇属, 它作为遗传学模式生物有如下特点：

1)生活史长短随温度而不同；

2)成年雌性蝇类长到12小时才成熟，便于确保雌性蝇类是处女蝇；

3)繁殖能力强；

4)突变种类多，染体数目少。

位于同源染体上的非等位基因在形成配子时，多数随所在染体一起遗传，若发生非姊妹染单体之间的交换可产生少量的重组型配子。位于同一条染体上的基因连在一起的伴同遗传的现象称为连锁（linkage）。连锁现象是英国遗传学家（W. Bateson）等人于1906年在香豌豆(Lathyrus doratus )杂交过程中发现。1911年摩尔根用果蝇做杂交实验，发现了同类现象，提出了连锁与互换的概念，称之为遗传学第三定律。

基因的交换率反映了两基因之间的相对距离。1910年，Morgen TH提出假设：假定沿染体长度上交换的发生具有同等的几率，那么两个基因位点间的距离可以决定减数分裂过程中发生重组染体的发生率，即重组分数。人们规定同一染体上两个位点间在一百次减数分裂发生一次重组的机会时，定义两位点间的相对距离为一个cM(centimorgan)。根据基因在染体上有直线排列的规律，把每条染体上的基因排列顺序（连锁）制成图称为遗传学图(genetic map)，亦称基因连锁图(gene-linkage map )。

三点测交就是通过一次杂交和一次测交，同时确定三对等位基因（即三个基因位点）的排列顺序和它们之间的遗传距离，是基因定位的常用方法。主要过程是：用三杂合体和三隐性个体杂交，获得三因子（F1），再使F1与三隐性基因纯合体测交，通过对测交后代

表现型及其数目的分析，分别计算三个连锁基因之间的交换值，从而确定这三个基因在同一染体上的顺序和距离。通过一次三点测验可以同时确定三个连锁基因的位置，即相当于进行三次两点测验，而且能在试验中检测到所发生的双交换。

实验内容

1.实验材料

1.1.生物材料：黑腹果蝇两个品系

(1)野生型果蝇，编号18，其性状为红眼(W)，长翅(M)，直刚毛(Sn)，基因型+++。文蛤刃

(2)三隐性突变体，编号6，其性状为白眼(w)，小翅(m)，焦刚毛(sn)，基因型为w ms n。

1.2.器材：果蝇培养基，无水乙醇，乙醚。

1.3.试剂：恒温培养箱，体视显微镜，培养瓶，棉花塞，麻醉瓶，透明塑料板，解剖针，毛笔，镊子。

2.实验步骤

2.1.实验果蝇的饲养：

三隐性突变体果蝇白眼小翅焦刚毛三个基因是位于X染体上的连锁基因，相对这三个性状的显性是野生型果蝇。实验前先把这两种果蝇分别饲养，7～8天以后，培养瓶中出现幼虫和蛹之后，将瓶中的成蝇转移出去。

2.2.选择亲本：

培养瓶中的果蝇羽化之后，选择6号三隐性雌性果蝇作为三点测交试验的母本，18号野生型雄蝇作为父本。

2.3.亲本杂交：

把三隐性的母本雌蝇和野生型的父本雄蝇放入同一培养瓶中，仔细检查确认无误之后，粘贴标签，填写实验名称，亲本性状，杂交日期，实验者姓名。每个培养瓶内放入1~2对亲本果蝇为宜。培养瓶放在24℃恒温箱中饲养。

2.4.去除亲本：

果蝇杂交7～8天以后，培养瓶中开始陆续有幼虫和蛹出现，这时就要把亲本去掉。

注意：去掉亲本时一定要去除干净，否则Fl代羽化之后再与亲本回交，其后代的性状就无法正确统计了。

2.5.F1代果蝇性状观察与统计：

再经过2~3天培养，Fl代果蝇会陆续羽化出来。要认真观察和统计Fl代中雌，雄果蝇各自的性状。

2.6.测交：

用F1代雌蝇和F1代雄蝇进行杂交，F1代雌蝇是杂合体，表现为显性性状。Fl代雄蝇X染体上的三个基因全是隐性，Y染体上又没有相对的基因，所以又是纯合体，把这样两种果蝇杂交又叫测交。

测交时从F1代果蝇中选8对果蝇放入4个新培养瓶中，(♀蝇无须是处女蝇)，贴好标签。为了得到更准确的实验结果，要求F2代果蝇体数目多，因此在做测交实验时，尽量多设定培养瓶样本。

2.7.去掉亲本：

果蝇培养7天，当培养瓶中有足够的幼虫和蛹后，去掉亲本。

2.8.F2代果蝇观察：

在体视镜下观察，理论上，F2代的表型可以有8种类型，实际上它们是8种雌配子基因型表达的结果，其中6种是重组合，只有二种是亲组合。

2.9.实验观察结果的统计与计算分析：

把观察到的果蝇性状种类和数量分别记录入表内。根据遗传学统计分析方法，分别计算本实验中的二个单交换率和一个双交换率。对照标准基因图进行实验数据的χ2检验，判断其相关性。

3.实验结果

3.1.实验时间

表1 三点测交试验流程

时间	操作
2011.10.19	接种亲本6♀×18♂
2011.10.26	倒掉亲代
2011.11.02	统计F130数量，接种，F1代自交
2011.11.09	观察F2代，若有幼虫出现则将F1代弃掉
2011.11.16	第一次统计F2各表型数量，继续培养
2011.11.21	第二次统计F2各表型数量

3.2.F1果蝇数量记录

表2 F1果蝇表型数量及频率

表型				数量	比率
性别	眼	翅长	刚毛	数量	比率
雌性♀	红眼（+）	长翅（+）	直刚毛（+）	63	51.64%
雄性♂	白眼（w）	小翅（m）	焦刚毛（sn）	59	48.36%
总计				128	1

3.3.F2果蝇数据记录与处理

表3 F2果蝇表型数量及频率

表型			计数	频率	重组位置
眼	翅长	刚毛	计数	频率	m-sn	w-sn	w-m
+	+	+	89	70.63%
w	m	sn	89	70.63%
+	+	sn	1	1.19%	√	√
w	m	+	2	1.19%	√	√
+	m	+	21	14.68%	√		√
w	+	sn	16	14.68%	√		√
w	+	+	17	13.49%		√	√
+	m	sn	17	13.49%		√	√
模拟训练系统总计			252	1	15.87%	14.68%	28.17%

3.4.结果分析

由于选取的亲本分别为三隐性性状的母本与野生型父本，显然二者皆为纯种。则Fl代果蝇中的雌性应该全部是红眼，长翅，直刚毛，表型都是野生型，基因型杂合；Fl代果蝇中的雄果蝇全部都是白眼，小翅，焦刚毛，表型都是突变型。

用于测交的F1代雌果蝇是三个基因的杂合体，X染体基因不完全连锁。减数分裂形成配子时，同源染体之间有发生交换的可能，即任何二个基因之间都有可能发生交换，三个基因之间也能产生双交换。假如这些理论上的交换是事实存在的话，那么，本试验中雌性亲本果蝇就可以产生8种不同的雌配子；雄性果蝇只产生两种配子，一种是含有不带有任何基因的Y 染体的雄配子，一种是带有三个隐性基因的X染体的雄配子。因此，这两种配子只对F2代的果蝇有性别影响，没有性状上的影响。

图 1果蝇X染体遗传图

图1显示果蝇X染体遗传图谱，可见w基因、sn基因与m基因的位置分别为1.5、21.0与36.1，故w-sn重组率为19.5%，sn-m重组率为15.1%。

则χ2分析结果如下

如何自制软玻璃 (Oi-Ei)2

χ2=Σ

如表4，对每一对基因的重组或不重组的实验值做χ2检验，得到三组实验数据的χ2，其自由度（df）为1。根据表5查询得，当df=1，p=0.05时，χ2=3.84，故统计学上三组数据与标准数据皆无显著差异，三组基因的重组率符合遗传图谱所示。

表4 基因重组率χ2分析

重组基因	m-sn不重组	m-sn重组	w-sn不重组	w-sn重组	w-m不重组	w-m重组
O	212	40	215	37	181	71
E	214	38	203	49	172	80
(O-E)2	4	4	144	144 熏蒸床	81	81
(O-E)2/E	0.0176	0.0989	0.710	2.93	0.470	1.015
Σ	0.117		3.64		1.49