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模式植物拟南芥Ｔ-ＤNA插入突变体的鉴定
摘要：
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离体中,有T-DＮＡ插入的纯合突变体,杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。本次实验意在对模式植物拟南芥Ｔ－DNA插入突变体进行鉴定。实验中用到的主要实验方法有:CTAB法提取拟南芥基因组DＮＡ、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。ＰCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。每完成一个循环需２~4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小,这就大大提高
了分辨能力。ＤＮA经EB染,ＥＢ可与核酸结合,在紫外光激发下产生荧光。现广泛应用于核酸的研究中。
引言
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的ＤNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞,并插入植物染体DNA中。所以Ｔｉ质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将Tｉ质粒进行改造,将感兴趣的基因放进T-ＤNＡ区段中,通过农杆菌侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。
T－DＮA插入基因内部导致基因突变:T-DNA插入到植物染体上的位置是随机的。如果T-DNＡ插入进某个功能基因的内部,特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。这使农杆菌Ｔi 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。
反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DＮA插入突变体的鉴定方法。其中,“三引物法”是主要鉴定方法之一。
“三引物法测井电缆”即采用三个引物(LP、ＲP、BP)进行ＰCR扩增。野生型植株目的基因的两条染体上均未发生T-DNＡ插入，所以其PCR扩增产物仅有1种，电泳结果为一条大带(由LP+RP这一对引物扩增出来);纯合突变体植株目的基因的两条染体上均发生T-DNA插入,也只能得到1种PCR扩增产物，电泳结果为一条小带（由BＰ+ＲP这一对引物扩增出来）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染体上发生了T-DＮA插入，所以PＣR扩增产物有2种,电泳结果为一条大带由（LＰ+RP多媒体集中控制器这一对引物扩增出来）和一条小带（由BP+ＲP这一对引物扩增出来)。电泳结果差异明显，能有效区插入突变体的类型。
此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DＮA的插入情况。本方法操作简单，成功率高,结果可靠，适用于从大量拟南芥T—ＤNA插入突变体中快速鉴定出突变体。
【实验材料】
1．试剂中频淬火变压器: 液氮,2*ＣTＡＢ提取液,氯仿-异戊醇(24：1）,无水乙醇，70%乙醇，TE,ＰCＲ反应体系(DNA模板（基因组DＮA），引物LP、RＰ、ＢP,缓冲液，MgCl２，dNＴＰ mixture,ddH2O，Ｔａq酶），琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖，1×TAE缓冲液,Ｌｏaｄｉng buffer，DＬ 2,０00 DNA Marｋer，λ-Hind Ⅲ DNＡ digeｓt Mａrｋer，溴化乙锭。
2.器具: 1.5ｍl离心管,水浴锅，微量移液器，离心机，PCＲ仪,微波炉，电泳仪,电泳槽，梳子，三角瓶，微量天平,手套,染盘,凝胶成像仪。
3．材料：拟南芥Ｔ-DNA插入突变体植株。
【实验步骤】
提取拟南芥基因组DNA
1. 在1．５ml离心管中放入2或3片拟南芥幼嫩叶片，用液氮将其研磨成细粉,向管中加入６00uｌ预热至65℃的2×CTAB提取液，轻摇混匀。
2. 65℃水浴30 miｎ，其间轻摇混匀。
3. 向上清液加入等体积的氯仿／异戊醇（24：１），室温下轻轻混匀10 min,12０00 rpm离心１5 min，再转移上清入新管。
4. 向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-２0 ℃ 下30 ｍin,1２0０0 ｒpm离心１5 mｉn,弃上清。
5. 用７0%乙醇洗涤沉淀一次,１２０00 rpm稍离心,弃上清。
6. 将沉淀晾干,加20-５0ul TＥ (ｐH 8.0)，65℃水浴３0 min溶解DＮA。
PCR
取3个PＣＲ小管(一个为三引物体系,另外两个为双引物体系),按照如下反应体系向ＰCR小管内加入样品，设定如下反应程序，进行PＣR。
反应体系:
三引物反应体系 ２5ul体系 | 双引物反应体系25ｕl体系 |
H2Ｏ | 15ul | H2O | 16ul |
10xTaq buｆfer (ＭgCl2free) | 2.５ｕl | 10xTaｑ buffer（MgCl2ｆreｅ) | 2．5ｕl |
MgCｌ2 无石棉刹车片(25mM) | 2ul | MgCl2 (25mM) | ２ul |
引物LＰ （1０ uＭ） | １uｌ | 引物LP或BＰ (10 uM） | 1ul |
引物RP (10 ｕM) | １uｌ | 引物RP(10 uM) | 应力传感器１ul |
引物BP (１0 ｕM） | 1ul | dＮTP (各2.5mM) | ０.5ｕｌ |
dNＴP （各2.5mM) | 0.5ul | 模板DNA(30-50ng／μl) | 2ul |
模板DNA(３0-５０ｎg/μl) | 2uｌ | Ｔaq酶(5U/μl ) | 0.2uｌ |
Tａq酶(5U／μl ） | 0.2ｕl | | |
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反应程序
预变性 94℃ 5min
变性 ９４℃ 40sec
退火 53℃ 50sｅc
延伸 7２℃ 80sec
循环35次
72℃ 10min
琼脂糖凝胶电泳
注：①电泳这一步骤，我与其余五名同学共同完成，共用同一块胶板。
②基因组DNＡ的电泳所用琼脂糖凝胶浓度为０.8%，PCR产物的电泳所用琼脂糖凝胶浓度为2% 。
１. 制胶：称取0．2４g琼脂糖，加入30mｌTAE缓冲液(用于基因组DNA的电泳）；另称取1.60ｇ琼脂糖，加入80mlTAＥ缓冲液(用于ＰCR产物的电泳）。放入微波炉中加热溶化。
２． 灌胶：待胶冷至5０－6０℃时，缓缓倒入胶板。约半个３０—40min后,胶已凝固，拔去梳子，将胶板放在电泳槽中,补充槽内ＴAE缓冲液，至约高出胶板１mm。
3． 加样：将样品与Lｏading ｂｕffｅr在封口膜上混匀，用微量移液器将样品加入到点样孔内。(基因组DNＡ加样量为5ul,PCR产物加样量为２０uｌ)
4． 电泳:接通导线（加样端接负极）,调节电压至5v／cm，当指示剂距胶板底部1-2cm时,停止电泳。
5. 染：将胶板放入含ＥB的染盘中，染约１０mｉn,再将胶板转移到清水中清洗。
６. 观察：将凝胶放入凝胶成像仪内观察、拍照。
【实验结果】
理论上,电泳结果图上会出现一条大带或一条小带或两条带同时出现，并且可以对T-DＮA插
入突变体的类型做出准确鉴定。各种可能的电泳结果对应插入突变的类型如下表：
电泳条带的有无 | 鉴定结果 |
1000－1500bp间 | 800-900bp间 |
有 | 无 | 野生型 |
有 | 有 | 插入杂合突变体 |
无 | 有 | 变速盘插入纯合突变体 |
| | |
但是由于多种可能，最终基因组DＮA和ＰCR扩增产物的电泳结果都没有出现预期条带。
对这一现象出现的原因分析如下:
由于班里大多数同学出现了同样的情况,只有极少数同学的电泳结果图上出现了条带,基本可以断定并非由实验操作造成。
【注意事项】
１． 实验取材为植株叶片，而不要将植株连根拔起。否则的话即便检测出实验材料为插入纯合突变体,由于植株已经不存在，实验结果就没有了意义。
2. 液氮研磨实验材料时,注意不要将液氮倒在手上，以免将皮肤冻伤。
3. 配制PCＲ反应体系时由于各种试剂量较少，要靠壁滴加。
４. 在用微波炉加热溶解琼脂糖的过程中，TBＥ缓冲液中的水分会蒸发掉一少部分，所以，最好在加热前在三角瓶内补充少量蒸馏水。
５. 注意电泳方向，点样孔所在方向对准电泳槽的负极(DＮA带负电荷，在电泳的过程中向正极移动)。
６. EB为强诱变剂,染时要佩戴手套,实验技术后认真清洗双手。
参考文献
[1]模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定.ppｔ
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