孙亚军;王亮;蔡俊
【摘 要】滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)的建立模拟了自然界中环状病原生物DNA通过滚环模型方式自我复制的原理,经长期科学研究和实践应用,取得了诸多突破性成果.对最近几年在滚环扩增技术研究领域的最新动态进行了较全面的总结,其中包括了网状RCA、锁式探针RCA、目标成环RCA和跨越式RCA,也对滚环扩增中存在的问题进行了探讨,重点介绍了该技术在基础研究、实际检测、医疗诊断及纳米材料等方面的应用,最后对核酸等温扩增技术产业化的发展前景进行了展望. 太阳能热水器清洗机【期刊名称】《生物技术进展》
【年(卷),期】2016(006)002
【总页数】7页(P130-136)
黑磷化【关键词】RCA;纳米材料;转基因;锁式探针
【作 者】孙亚军;王亮;蔡俊
【作者单位】湖北工业大学工程技术学院,发酵工程教育部重点实验室,武汉430068;湖北工业大学工程技术学院,发酵工程教育部重点实验室,武汉430068;湖北工业大学工程技术学院,发酵工程教育部重点实验室,武汉430068
【正文语种】中 文
建立于20世纪90年代中期的滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)，模拟了自然界中环状病原生物DNA通过滚环模型方式进行自我复制的原理，在研究初期就得到了世界范围内科研人员的高度关注。经过不断研究和改善，现已成为了包括DNA链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)和依赖解旋酶的恒温基因扩增(HDA)等核酸恒温扩增技术中的重要一员。与传统的核酸扩增技术相比,RCA技术摆脱了对精良仪器的依赖和进行反复热变性等缺点的局限，且有较高的灵敏度和特异性，反应时间也相对缩短，使得以此项技术为基础的核酸扩增检测技术能更有效的投入到普遍和成规模的实际应用中。通过对目前国内外在滚环扩增技术中的研究及应用调查发现，相较国外，我国的RCA应用研究还是有些不足，因此本文对最近几年国内外在滚环扩增技术研究领域的最新动态进行了较全面
的总结，对滚环中存在的问题进行了探讨，介绍了该技术在基础研究、实际检测、医疗诊断及纳米材料等方面的应用[1,2]，以期为我国科学研究中RCA技术的广泛应用提供参考。
最早对RCA技术的研究包括了线性RCA(即单引物RCA，又叫LRCA)、指数RCA(即双引物RCA，也被称为超分支滚环扩增，HRCA)、多引物RCA和免疫RCA等[3,4]。RCA技术操作的基本原理是在DNA聚合酶作用下，引物沿着环状模板链延伸和扩增，产物为与单环模板序列完全相同的线性链，但长度却扩大了数千倍[5]。随着RCA技术的发展，研究者在这几种比较基础的RCA技术上不断改善、创新，开发了一批更加高效和实用的RCA技术，其中就包括了如网状RCA、锁式探针RCA、目标成环RCA和跨越式RCA在内的一系列RCA技术。 幻听的中药在LRCA和HRCA的基础上建立的网状RCA(net rolling circle amplification，NRCA)是引入了切刻内切酶的一种更高效率的核酸扩增技术，切刻内切酶可识别双链中特定的核苷酸序列，并只切割双链中的一条单链。其在LRCA阶段的产物上设计了一个切刻内切酶的酶切位点，切割下的单链与环状DNA模板互补并充当引物，从而继续诱发LRCA和HRCA反应，使其在LRCA和HRCA基础上实现了进一步的扩增，扩增产物的原子力显微表征显示为
吸波>美甲器>二维液相谱结构较为单一的网状结构。如果把LRCA产物视为树干，那么HRCA就是具有众多枝桠的一棵完整大树，NRCA则是发展为由无数棵大树组成的茂密森林(图1)[6]。与LRCA和HRCA相比，该技术一方面没有牺牲原有技术在操作性、使用成本和扩增所需时间等方面的优势，另一方面其在原有技术基础上进一步实现了信号放大，从而为更低丰度核酸样本的分析检测提供了良好的技术条件[6]。
经特异性生成环状DNA，HRCA和LRCA都可用于线性DNA的扩增，即只有目标DNA存在的条件下，另一条线状DNA才可成环，且只有成环的线状DNA才可以进行复制和扩增，为了进一步保证此反应的特异性，可采用双切口滚环扩增[7]。线状探针DNA的长度只有几十个碱基，两端能与目标DNA一段连续的序列相结合，在探针两端序列之间留一段缺口，通过在缺口处设计既能发挥探针功能又能行使引物作用的一段序列，且当另一部分探针和设计的引物序列都和模板完全互补配对后，两个切口才能被连接酶特异性连接成环，也只有这种由两部分探针形成的环状模板才能在两条引物作用下扩增。这个方法类似于将线状DNA分子特异性地锁定在目标DNA上，可以很好的应用在单核苷酸特异性基因诊断的研究中[8]。
目标成环RCA(target circle RCA,TC-RCA)克服了锁式探针RCA的单链探针不稳定、探针与模板容易错配、扩增产物并非目标序列而是互补探针自身等缺点。用限制性内切酶酶切样品，产生具有9nt粘性末端的序列，其次，设计与目标序列粘性末端完全互补配对的双链接头，经连接酶的作用，同目标序列连接成环，然后再利用具有链置换活性的DNA聚合酶，在两条引物的作用下引发HRCA，最后，扩增产物再经过限制性内切酶酶切，得到扩增后的目的片段。TC-RCA能在无背景信号的条件下扩增目标DNA片段，同时接头能稳定结合于固相磁珠表面而不影响扩增，因此能在芯片上实现目标成环等温扩增。在此基础上，利用高特异性的DNA连接酶、生物素修饰接头、链霉亲和素磁珠以及磁性分离等手段，构建了磁珠辅助的TC-RCA技术。该项技术能够在等温条件下从大量背景核酸中检测出目标序列，从根本上解决了检测特异性和灵敏度之间的矛盾关系，在检测食品中的有害微生物方面十分适用[9]。
通过具有链置换活性及热稳定性的Bst DNA聚合酶引入RCA反应所提出的跨越式滚环等温扩增(stride RCA,SRCA)，对RCA反应中所产生的背景信号机理提供了线索，其原理和过程与早期指数RCA和多引物RCA类似，但由于Bst DNA聚合酶具有在聚合过程中不受DNA缺口影响的特殊活性，当核酸合成过程中遇到复制模板缺空后可跨越并继续合成延伸，因
此，SRCA能够以非闭合环形DNA为模板启动扩增反应。Bst DNA聚合酶最开始以上游引物为模板合成其互补链形成双链DNA后，该酶发挥核苷酸转移酶活性在其引物的3′末端沿5′→3′方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸序列，即DNA的合成反应跨越了互补链与下游引物间的缺口，以下游引物为模板继续互补配对；然后Bst DNA聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到下游互补序列的3′末端后形成寡聚核苷酸序列，继续催化聚合反应合成互补新链，完成一轮合成；最后，通过其链置换酶活力替换上一轮引物，往复进行滚环扩增，从而形成重复扩增产物。通过该特性设计的非闭合模板，巧妙设计引物，避免了引物之间的扩增，该技术能很好的驱动RCA反应，为基于RCA技术的检测方法及开发提供了新的理论依据和借鉴意义，也对开发等温扩增技术检测微生物有一定帮助[10]。
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