D ()l ：10. 13523/j .cb . 2011014
时忠林1崔俊生2杨柯2胡安中2李亚楠2刘勇2邓国庆2朱灿灿朱灵
(1安徽大学合肥230601)
(2中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所安徽省生物医学光学仪器丨：程技术研究中心
安徽省医用光学诊疗技术与装备X 程实验室合肥230031)
摘要核酸等温扩增技术是一种在恒温体系内对核酸进行高效扩增的分子扩增技术，它能够在 短时间内实现目的基因的指数增长。微流控芯片（microfluidic c h i p )技术是把研究样品制备、核酸 富集、纯化和检测等多个操作步骤集成到一块“微型化”的芯片上，经自动化处理，得出实验结果，即“样品进，结果出”。将核酸等温扩增技术与微流控芯片相结合，不仅可以实现核酸快速扩增，还可以降低对实验器材的依赖，在床边即时诊断、病原体快速筛查中具有广阔的应用前景综 合国内外相关研究报道，综述了各种等温扩增技术原理，以及基于微流控芯片的核酸等温扩增技 术应用，展望了集成化微流控芯片的发展趋势和应用前景 关键词微流控芯片核酸等温扩增床边即时诊断
中图分
类号
Q 52 Q 819
近20年来，分子生物学技术在临床医学中的应用 逐渐增多，它与生物医学的联系日益紧密。分子生物 学技术的高速发展推动了生物医学的前进；同时，核酸 体外检测技术的发展为传染病控制及慢性疾病提 供了一种快速、灵敏的分子诊断方法。核酸等温扩增 技术作为一种新兴的体外检测的辅助技术，受到越来 越多检验、检疫人员的注视1]。与传统的聚合酶链反 应（polymerase chain reaction , PCR );24：相比，等温扩增 方法因具有特异性强、检测快速、操作简便等优势而被 广泛用于细菌、病毒的核酸检测；不需要反复升降温，降低了仪器设备的复杂程度，正成为PCR 理想的替代 方法。
微流控芯片技术5具有样品消耗少、检测快速、易 于实现自动化等特点，在临床医学检验、分析化学、分 子生物学等研究领域的应用越来越多伴随着微流控 芯片技术的不断发展与改进，芯片集成的单元部件越 来越多样化，通过对多个单元部件的拼接，可以在单个
收稿口期:202C M U )5 修回日期:2020-丨2-24
*
国家自然科学基金（82002189 )、安徽省自然科学基金
(2008085 y F 311)、安徽省重点研发计划（202004<107020014 )、中科
院合肥研究院•‘火花”基金（Y /J J 2020Q N 35 )资助项目
**通讯作者，：zhul@ai(>fm_ ac. (.n; zhu(.an(.an@aiofm_ ac. cn
中国生物工程杂志 China Bi «technology ，2021，4丨（2/3) :116-128
芯片上形成具有多功能、集成化、_丨动化的微全分析系 统6;。微流控技术和生物传感器技术的结合，可以将 生物样品的制备、分析物的标记、富集、纯化和检测等 步骤集成在一个小型化的平台上，以有限的试剂高精 度、自动化完成相应的化学反应，解决了传统设备核酸 检测的局限性i 同时，微流控芯片在处理样品时，由于 微董化和自动化操作，不仅减少人力、财力的消耗，降 低实验成本，还能节约时间，满足核酸现场快速检测的 要求。
目前，关于核酸等温扩增在微流控芯片中应用，主 要集中于借助微流控芯片，利用等温扩增技术进行核 酸快速检测。鉴于前人的相关研究成果，本文综述了 在微流控芯片上等温核酸扩增技术的进展，讨论了各 项核酸等温扩增技术的原理及最新应用并将在文章 最后讨论将核酸的提取、纯化、富集、检测等过程集成 到一个微型化芯片中所遇到的问题及解决方案。
1核酸等温扩增技术
核酸作为生物体内四大组成物质之一，在生物体
内，尤其是在遗传、蛋白质发挥功能等方面发挥重要作 用核酸被誉为生命体的“身份证但由于提取样本
2021,41(2/3)
时忠林等：基于微流控芯片的核酸等温扩增技术研究进展
117
中核酸含量低，需要将特异性遗传信息放大后，才能准 确的反映某一生物的基因身份目前，应用最多、最广 泛的核酸扩增技术是P C R ；然而，随着实验仪器的更新 和实验人员对实验效率要求的提高，20世纪90年代以 来，无须热变性的核酸等温扩增技术（isotliemiiil nucleic
a (.i (l amplification )得以发展，受到更多科研:I ：作者的青
睐目前，根据核酸扩增中单链D N A 形成方式上
的差异，可以将核酸等温扩增技术分为4类：I )N A 聚合 酶介导的扩增反应、酶促解旋或引物退火的扩增反应、 单链剪切酶辅助的扩增反应和基于m R N A 转录的扩增 反应〜1:。
(1) D N A 聚合酶介导的扩增反应，主要代表有环 介导等温扩增技术（lm >p - mediated isothermal
amplification , L A M P ) [l :r
、交叉引物扩增技术（cross priming amplification , C P A )
、滚环扩增技术 （rolling
circle amplification ，R C A
) ■15 及多重置换扩增（multiple
displacement amplification ，M D A
) 16_’等：这类扩增方法
卡口系统
主要是通过设U •特殊的引物序列以及具有链置换功能 的1)N A 聚合酶，在等温条件下，使双链D N A 解螺旋为 单链D N A ，从而产生引物结合位点，引物与模板序列上 引物结合位点的配对促使核酸扩增
过程的进行，不断 循环而达到核酸扩增的目的。
(2)
酶促解旋或引物退火的扩增反应，主要代表有 重组酶介导扩增（recombinant enzyme mediated
amplification , R P A
) 17_、依赖解旋酶的扩增（1«1丨〇386-
dependent amplification , H D A
)[18」。这类方法主要是通
过使用r »N A 解旋酶对目标双链D N A 进行解旋，形成 单链D N A 序列或是利用重组酶-引物复合体特异性识 别双链D N A 上的目标序列，并且使引物与模板D N A 序列上的引物结合位点结合，进而实现核酸扩增。
(3)
单链剪切酶辅助的扩增反应，代表技术为链替
代扩增（strand displacement amplification，S D A )丨9■，这 种方法主要利用限制性核酸内切酶来结合D N A 总的 来说，这种扩增技术通过特殊设计的引物序列或特殊 功能的酶进行辅助，不断形成新的引物结合位点，保证 扩增反应持续进行。
(4)
基于mRNA 转录的扩增反应，如依赖核酸序列
等温扩增（nucleic acid sequenre-based amplification ,
I N ASBA ) M 和转录介导的扩增（transcription-mecliated amplification，TMA ) _2°_21 '。这类扩增技术主要是对
K N A 进行指数扩增，在扩增过程中需要逆转录酶和 R N A
聚合酶的加人，通过转录合成R N A 本篇综述，将
重点介绍以下几种等温扩增技术的原理及其在微流控 芯片上的应用前景，并在文末对几种恒温扩增技术的 性能进行比较（表1)。1.1环介导等温扩增
环介导等温扩增技术（L A M P )是由Notomi 22]及其 团队于2000年首次提出的，它是到目前为止应用最广 泛、技术最成熟的一种恒温扩增技术。其基本原理是： 靶D N A 解旋后，以单链D N A 为模板，内外引物特异性 识别、结合相应的引物位点，在Bst -D N A 聚合酶作用 下，进行哑铃样D N A 结构的合成，通过不断循环操作， 最终形成环状i )N A 混合物m
玻璃加工工艺(图1)。
L A M P
引物的设计：前向内引物（F I P )，5'端基因
的F 2序列和F l c 序列；后向内引物（B I P ) , B 2序列和
B l c 序列在5'端。外引物设计在F 3
和B 3区域。它使
用了一条D N A 链，形状类似一个哑铃，两端都有环状 结构这种起始物质被用来启动一个循环的放大反 应。产生了相对于起始物质具有反向结构的D N A ，并 (1通过同样的反应再次形成起始物质。
由于临床医学检验、诊断等领域对核酸检测的时 效性提出了更高的要求，快速核酸扩增技术就越显重 要伴随着微流控芯片设计的发展，以及环介导等温 扩增技术所具有的扩增快速、操作简单、特异性强等特 点，受到越来越多的临床检验人员和研究学者的重视。
2010年，F a n g 等:26设计了一种结构类似于树形芯片的 多重微流控L A M P 芯片。在芯片设计上采用叠加、修 饰的原则，首先用软印刷技术（soft lithography )构建芯 片微结构，然后将〇2等离子体在闭合作用下形成亲水 通道，最后以P D M S 封闭芯片，完成芯片全局设计。利 用这种芯片进行L A M P 扩增，扩增产物可以通过肉眼 比浊法进行检测（图2)。
在过去的10年中，许多L A M P 检测方法被用于基
因分析=例如，对医学、农业中的重要病原体进行检测 诊断27匕未来，L A M P 技术的高速发展必将与微流控 芯片的完美设计结合密不可分。目前，中国的微流控 芯片市场中，以博奥生物的蝶形芯片为代表，是最成 熟，也是与L A M P 技术结合效果最好的一款商业化产
品。博奥晶典将Q -I A M P 恒温扩增技术与碟式微流控 芯片技术相结合，研发出C C I D (c h i p s for complicated
infection diagnosis )产品，能够对临床常见的细菌、真菌、
病毒等100多种病原微生物进行快速检测，并且同时 对30多种细菌耐药基因进行检测，在4 ~ 8h 内完成检 测，为临床用药提供参考。
中国生物工程杂志China Biotechnology V〇l.41 No.2/3 2021 118
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图1LAM P反应原理图[25]
Fig. 1LAMP reaction schematic
(a) Designing LAMP |)rimer (li) The fonning stage of circulus (c) Cycle amplification stage
1.2交叉引物等温扩增技术
交叉引物等温扩增技术（C P A)是中国具有自主知 识产权的新型恒温扩增技术，由杭州优思达生物公司 在2012年首次提出其扩增体系中包括扩增引物、交叉引物和Bst-D N A聚合酶，这些靶核苷酸链能依 靠Bst-D N A聚合酶的链置换特性和引物延伸，达到核 酸扩增P的：其基本原理是：Bst-D N A聚合酶使扩增引物和交叉引物不断延伸，同时引物和扩增产物不断地杂交、延伸，达到加快扩增进程的丨-丨的：由于扩增体 系中含有特殊标记的探针，可以根据探针的特点设计扩增产物的检测方法™31，从而提高产物检测效率。
C P A是现阶段被大力推广和运用的一项新技术。目前，C P A在与微流控技术结合方面应用还不够成熟，但是c p a技术特有的优势，也获得r生物医学研究、
检
2021,41(2/3)H、f忠林等：基于微流控芯片的核酸等温扩增技术研究进展119
图2八通道PDMS-玻璃混合微流控芯片和定量分析装置[26]
Fig. 2 Eight-channel PDMS-glass hybrid microfluidic chip for LAMP and Quantitative analysis unit
(a) Photograph of an eight -channel P D M S-glass hybrid microfluidic chip ( b)Schematic drawing of an eight -channel P D M S -glass hybrid
microfluidic chip (t.)Photograph of the (juantitative analysis unit (il) Schematic illustration of the quantitative analysis unit
验检疫、医学疾病即时诊断（P O C T)等方向从业者的青 睐C P A的优势主要体现在：①对实验仪器要求低；
②避免产生E B等有害物质;③操作简单、效率高;④通 过侧横流试纸条技术快速得到检测结果。2018年，C—等[32]应用C P A扩增技术与多重巢式芯片相结合 的实验设计理念，对食物中致病微生物金黄葡萄球菌进行快速检测。结果显示，与P C K扩增技术相比，与 芯片结合的C P A技术在检测敏感性上没有明显差距，但是检测效率大大提高，可以同时检测多株致病菌；同时，通过试纸条侧向流检测，结果表现出良好的特异性 和重复性；全世界每年大约有200万人死于肠道疾病，快速检测食源致病菌在临床中显得异常关键。利 用C h e n等设计的微流控芯片可以在患者早期诊断中发挥关键作用，抓住疾病的关键期。2014年，W a n g等&报道了在纸基芯片上利用C P A技术对转基 因水稻进行专一点检测，通过添加1%的普鲁兰多糖，进 一步缩短检测时间；同时添加S Y T09作为核酸染剂，便于实验结果观察由于C P A技术起步较晚，同时扩增 过程中需要探针设计，增加了实验成本。
与P C R技术相 比，许多实验室更青睐于使用后行；交叉学科的背景也限 制了 C P A技术与微流控芯片设计的结合使用。然而，随 着科研领域更加注重科研人员学科交叉背景的培养，未 来C P A技术必将在微流控芯片中得到广泛应用。
1.3滚环扩增技术
滚环扩增技术（R C A)主要用于大环状D N A的扩 增”，它于1995年首次被Fire提出15。它的基本原 理是：在D N A聚合酶作用下，首先由短的引物与单链环状D N A结合位点结合，启动扩增过程，按照碱基互补配对原则进行延伸，生成大M与环状D N A序列互补 的重复序列的线状D N A单链，从而达到短期内核酸大 量扩增目的M_36 (图3)。
Fig. 3 RCA reaction schematic
由于RCA技术不仅可以直接扩增D N A，还可以实 现对靶基因的信号放大，灵敏度可以达到一个拷贝”'w，因此在临床诊断中，尤其是基于微流控芯片平 台的临床初期筛查、核酸检测及免疫等研究具有很大的应用价值和潜力W:。Miller等40成功构建出人血清 蛋白抗体的微流控芯片，这种抗体芯片在前列腺患者和健康人血清蛋白表达差异上的检测灵敏度较高，可 以作为临床诊断的初步筛选，为后期的进一步诊断提供科学依据；Nallin■等41设计将挂锁探针和RCA 集成到微化学芯片中，通过微珠R C A进行单分子扩增，创建一个用于法医、环境和食品应用的目标D N A检测 和量化的综合分析系统。
1.4重组酶介导扩增
重组酶介导扩增（R P A)是由P ie pe nb ur g等;17’42
于
120中国生物工程杂志China liiolerhnology Vol.41 No.2/3 2021
2006年首次提出的，它是一种利用重组酶使模板解螺旋，从而使模板D N A快速扩增的方法。R PA的基本原 理是：利用重组酶-引物复合体特异性识别模板D N A的互补序列，重组酶使双链D N A解螺旋，并让特异性K NA引物和粑标序列结合。引物延伸使得新的DNA 单链不断合成，同时S S B与另-条游离的单链结合。新合成的双链[)N A再作为下一循环的扩增模板，从而 实现短期内D N A指数扩增（图4h扩增产物的实时信号检测可以通过使用T w i s t A m丨)® e x u探针来进行。这 鸣介成的寡核苷酸携带一个内部荧光团和合适的猝灭 剂，彼此非常接近，两者都与胸腺嘧啶碱基相连，由一 个碱基位点模拟物（四氢呋喃）隔开：这些内部修饰位于探针的1端。当结合到目标D N A分子时，碱基位点 被核酸外切酶识别和切割，促使携带猝灭剂的较小下游探针部分的释放，从而分离荧光素和猝灭剂。所产 生的荧光信号与D N A的扩增数呈正相关。
Forward primer Backward primer
门襟衬衫DNA polymerase、u u
图4 R PA反应原理图
直埋蒸汽管道
Fig. 4 RPA reaction schematic
最近，K i m等[43'将微流控平台和R PA结合，开发 丫一种新型病原体富集培养平台。该富集平台主要通 过提高对样本中病原体的捕获效率，达到快速富集的 目的。利用该平台对含沙门氏菌尿液和含布鲁氏菌尿 液进行检测，大约l h就能观察实验结果，且灵敏度极 高，在临床快速检测方面具有良好的应用前景；Fan 等44通过荧光R P A扩增与微流控芯片结合来检测大肠杆菌。在实验设计上，通过原盘型的芯片设计，重复 单元的微流控结构满足了多重反应的要求。同时，T w i s t A m p® e x o荧光探针的加人，使得扩增产物可以通 过荧光值计算，达到了微流控芯片一体化和等温扩增高效、快速的目的；利用等温K P A分析的可编程数字平 台与液滴微流体相结合，用于细菌耐药的快速检测，已被证明有希望检测P-内酰胺耐药基因W a C r a-M-75。Lutz等:45将R P A分析整合到基于箔片的离心微流体LahDiS(•系统上（图5 )，用于核酸的全自动分析，可在 20m i n内检测低至l Oc opies的金黄葡萄球菌的抗生素抗性基因A/ec.4的D N A序列
目前，我们课题组利用l i P A技术与卡盒芯片相结 合，用于耐药菌快速检测，实现现场即时检测（point 〇f care test,P0C T)的目标。未来，K P A技术在微流控芯 片上的应用可能会涉及农产品药物残留检测、家禽瘟 疫快速诊断、法医鉴定等各个方面。
喷射装置1.5依赖解旋酶的扩增
依赖解旋酶的扩增（H D A)是由N E B公司于2004 年首次提出的，它是通过模拟体内D N A
扩增而设计的
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